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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
1.從牛蒡子藥材中提取牛蒡子苷,優(yōu)化提取分離及純化工藝,將所得牛蒡子苷純品作為本課題研究試藥應(yīng)用到后續(xù)研究中,同時(shí)為牛蒡子苷的工業(yè)生產(chǎn)工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
2.研究牛蒡子苷(AT)對(duì)高糖作用下的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移和血管生成是否有抑制作用,并從其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF-A)、低氧誘導(dǎo)因子( HIF-1α)、PI3K/Akt及MAPK/ERK信號(hào)通路的影響入手,探討其作用機(jī)制,尋
2、找作用靶點(diǎn),為糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的防治提供新的途徑。
方法
1.以AT含量為指標(biāo),通過(guò)正交試驗(yàn),優(yōu)化AT的醇提工藝;經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱粗分,篩選出效果最好的吸附分離方法;最后采用硅膠H柱層析,純化AT,得到AT純品。
2.體外培養(yǎng)HUVECs,應(yīng)用高糖(25.0 mmol/L)誘導(dǎo)建立細(xì)胞模型。MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同葡萄糖濃度對(duì) HUVECs的影響, DAPI染色等方法觀察 AT對(duì)高糖誘導(dǎo)的 H
3、UVECs凋亡情況的影響;MTT法檢測(cè)AT對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AT對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響,體外小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè) AT對(duì)細(xì)胞血管生成的影響,western blotting法檢測(cè)AT對(duì)HIF-1α、VEGF-A、PI3K、Akt、 Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。
結(jié)果
1.通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定了 AT的最佳醇提工藝為:脫脂后的牛蒡子干燥粉末,經(jīng)8倍量90%乙醇,回流提取3次,每
4、次2 h,得AT醇提浸膏。醇提浸膏用20%乙醇溶解加水稀釋后靜置得上樣液,過(guò)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱,收集50%乙醇洗脫液,得AT粗分物。AT粗分物經(jīng)硅膠H層析柱,氯仿:甲醇(9:1)洗脫,TLC跟蹤,收集單點(diǎn)流份,重結(jié)晶得AT純品,純度達(dá)98%以上。
2. MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示高糖能促進(jìn)細(xì)胞增殖;DAPI染色法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示高糖不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,AT對(duì)細(xì)胞凋亡也沒(méi)有影響。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)高糖刺激3、5、7 d
5、后,與LG組比較, HG組細(xì)胞增殖能力明顯增加(P<0.01);與HG組比較,HG+AT組的細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05或P<0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, HUVECs在高糖刺激下,與LG組比較,HG組細(xì)胞遷移能力明顯增大(P<0.01);與HG組比較,HG+AT組的細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.01)。小管形成實(shí)驗(yàn)顯示,4 h時(shí),HUVECs在高糖刺激下,與 LG組比較,HG組細(xì)胞血管腔形成能力增強(qiáng)(P<0.01);與HG組比
6、較, HG+AT組的細(xì)胞血管腔形成能力明顯下降(P<0.01)。western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示,高糖誘導(dǎo)的HUVECs中HIF-1α、VEGF-A、PI3K、Akt、Ras蛋白表達(dá)量及 p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)量比值均增加(P<0.05或P<0.01),經(jīng)藥物處理后蛋白表達(dá)量均下降(P<0.05或P<0.01)。
結(jié)論
1.本課題確定的 AT提取純化方法方便、穩(wěn)定,為工業(yè)大生產(chǎn)提供可靠的
溫馨提示
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