基于化學(xué)生物學(xué)的中藥有效成分牛蒡子苷元等的作用靶點及體內(nèi)分布研究.pdf

1、化學(xué)生物學(xué)是一門用新穎的化學(xué)方法來闡釋和操縱生物系統(tǒng)，研究生物學(xué)現(xiàn)象，解決現(xiàn)實世界中的生物學(xué)問題的學(xué)科。近十年來，化學(xué)生物學(xué)得到長足的發(fā)展，其影響已經(jīng)拓寬到了更廣泛的學(xué)科領(lǐng)域。中藥的化學(xué)生物學(xué)將傳統(tǒng)的基于結(jié)構(gòu)的中藥化學(xué)成分研究，引入到“生物學(xué)活性”研究的新層面，在分子靶標和作用機制的基礎(chǔ)上，闡釋有效成分的核心結(jié)構(gòu)與其靶標蛋白的作用關(guān)系。然而中藥藥效成分的體內(nèi)吸收、代謝和分布等具有復(fù)雜性，通常其在體內(nèi)又具有“多重靶點”的特性，這就給中藥的

2、化學(xué)生物學(xué)研究帶來了很大的挑戰(zhàn)。為了建立中藥藥效成分的化學(xué)生物學(xué)研究平臺，本論文分別選擇了牛蒡苷元和甘草次酸作為實例，展開了作用靶點確證和代謝分布的化學(xué)生物學(xué)研究。
　　本論文首先采用懸浮聚合技術(shù)制備了聚乙烯醇磁性微球，開展了基于點擊化學(xué)反應(yīng)捕獲靶標蛋白的磁性捕獲技術(shù)的研究。一方面以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，采用熒光素以及疊氮對其進行了雙標記;另一方面通過逐步反應(yīng)將磁球的端位引入了炔基基團，中間修飾了二硫鍵結(jié)構(gòu);使得該磁球

3、可以基于點擊化學(xué)的方法特異性的捕獲疊氮修飾的BSA，又可以通過還原二硫鍵而將捕獲蛋白解離下來。以此為模型通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法來檢測磁球捕獲的蛋白的能力，并通過響應(yīng)面設(shè)計對微球的粒徑和官能團覆蓋度等參數(shù)進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳性能磁球的粒徑范圍為1.25-6.31μm，官能團覆蓋度范圍為48.53-73.05％，其捕獲蛋白能力最強，約每毫升磁球捕獲67.07μg的BSA，與實際捕獲量（63.92±0.18μg）非常接近，證實了模型

4、的可靠性并可以進行特異性靶標蛋白的富集。
　　其次，本論文利用疊氮標記的非天然糖1，3，4，6-O-乙酰-N-疊氮乙酰胺(Ac4ManNAz)孵育人肺腺癌A549細胞，通過代謝標記手段產(chǎn)生了疊氮標記的糖蛋白，再使用上述炔基修飾的磁球?qū)ζ溥M行捕獲分離。發(fā)現(xiàn)1 mL磁球可以分離得到51μg細胞表面糖蛋白，驗證了基于點擊化學(xué)方法捕獲糖蛋白的可行性。在此基礎(chǔ)上本論文制備了疊氮修飾的聚乙烯醇磁球和炔基化修飾的牛蒡苷元，通過點擊化學(xué)反應(yīng)，針對

5、人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)開展了捕獲牛蒡苷元靶蛋白的研究。PharmMapper數(shù)據(jù)庫的靶標預(yù)測結(jié)果顯示，牛蒡苷元抗炎靶點可能為3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDPK1)。經(jīng)SDS-PAGE電泳和western blot分析，利用抗PDPK1抗體驗證了PDPK1蛋白大量存在于所磁性捕獲的蛋白中。進一步結(jié)合分子對接及分子動力學(xué)分析，證實牛蒡子苷元與已知的PDPK1抑制劑253具有相近的作用方式及作用強度，初步確認PDPK1為牛蒡子

6、苷元的作用靶點之一，為深入研究牛蒡子苷元的作用機理打下基礎(chǔ)。
　　為了改善磁球捕獲靶蛋白技術(shù)在組織細胞定位觀測以及在蛋白捕獲量上的局限性，本論文迸一步又設(shè)計了一種新穎的聚賴氨酸自組裝熒光納米球，經(jīng)透射電鏡形態(tài)觀察該微球大小均勻，粒度分析結(jié)果表明平均粒徑為38nm。經(jīng)酶標儀熒光檢測，552 nm激發(fā)波長下，其最大發(fā)射波長為596 nm，熒光強度可以達到相同濃度Rhodamine溶液的兩倍，提高了捕獲載體的生物相容性、熒光可示蹤性以及

7、捕獲分離的便捷性。進一步對其進行了疊氮功能化修飾，并通過點擊化學(xué)反應(yīng)與炔基牛蒡子苷元結(jié)合，制備了連接有牛蒡子苷元的熒光納米球。將上述微球通過尾靜脈注射用于急性肺炎小鼠，進行活體成像分析，發(fā)現(xiàn)其胸腔的濃度明顯升高;離體各器官的熒光強度測定也顯示，模型組小鼠肺部的熒光強度可以達到其它器官的2倍以上，證實了牛蒡子苷元的靶點主要集中在肺部。利用人支氣管上皮BEAS-2B細胞開展牛蒡子苷元的細胞成像研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)合有牛蒡子苷元的熒光納米球在細胞內(nèi)有

8、結(jié)合特異性，證明牛蒡子苷元的靶點主要分布在胞漿中。
　　利用上述合成的連接有牛蒡子苷元的聚賴氨酸熒光納米自組裝納米球以及空白納米球，分別對BEAS-2B細胞中的靶蛋白進行了捕獲研究。經(jīng)過流式細胞分析，確定了共同孵育3h為最佳的捕獲時間;通過裂解細胞和超濾對捕獲蛋白進行富集，并經(jīng)DTT還原和超濾濃縮得到了相應(yīng)的結(jié)合蛋白。SDS-PAGE電泳分析顯示，陽性蛋白富集率遠遠高于和陰性蛋白。經(jīng)HPLC-MS/MS鑒定，陽性組共鑒定出675種

9、蛋白，陰性組為750種蛋白;使用Protein Score和Coverage軟件進行條件過濾，發(fā)現(xiàn)其中陽性樣品中有19種蛋白，陰性樣品中有14種蛋白為可能的目標蛋白;進一步采用生物信息學(xué)工具String9.0和KEGG對目標蛋白的相互作用關(guān)系進行分析，最終將陽性蛋白樣品劃分為4個功能組，分別與能量代謝、炎癥、鈣調(diào)節(jié)和熱休克等功能相關(guān);而陰性樣品只能劃分出1個細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白組，證明為非特異性吸附的蛋白。進一步通過AutoDock4.0軟

10、件將上述陽性蛋白與牛蒡子苷元進行分子對接，確認其可能的蛋白靶點。篩選結(jié)果表明，牛蒡子苷元對肽基脯氨酰異構(gòu)酶(PPIA)，熱休克蛋白70(HSPA8)，肌動蛋白γ1(ACTG1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等顯示出較強的結(jié)合力，結(jié)合能分別為-7.89，-7.62，-7.27和-7.22 kcal/mol，并存在合理的氫鍵結(jié)合，證實了牛蒡子苷元的作用靶點為PPIA，HSPA8，ACTG1和GAPDH，分別與胞內(nèi)鈣離子、熱休克抑制、炎

11、癥通路和調(diào)控能量代謝相關(guān)。
　　最后，本論文圍繞桔?！耙?jīng)報使”改變甘草的藥效分子甘草次酸的動態(tài)分布過程開展化學(xué)生物學(xué)研究。分別對甘草次酸進行衍生化，制備可用于甲苯磺酰氯親核取代進行放射性18F標記的前體衍生物，并對其18F標記條件進行探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過羧基衍生的直鏈羥基取代后再進行親核取代，利于18F-甘草次酸的合成，產(chǎn)率為16.9％，放射性強度為150mCi，放射化學(xué)純度為98.6％。以此為基礎(chǔ)建立了基于PET的甘草次酸藥代

12、分布研究模型，以口服桔?？傇碥者M行干預(yù)，再通過小鼠尾靜脈注射18F-甘草次酸，分別對主要器官的血藥濃度進行了在線活體的觀測。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在注射前一次性灌胃給桔?？傇碥?50g/kg)組，從給藥7 min開始至115 min，肺部18F-甘草次酸的濃度明顯升高，為對照組的2.7倍，而其它器官沒有明顯的變化，印證了桔梗能夠引甘草上行的觀點。而在注射前一周每天灌胃給藥上述相同計量的桔?？傇碥?，注射當天停止給藥，同樣觀察藥代分布變化，結(jié)果發(fā)

13、現(xiàn)幾乎沒有改變甘草次酸藥代分布的效果。因此推測，可以是藥物相互作用的原因改變了甘草次酸的藥代分布，具體分子機制還有待進一步研究。
　　本論文采用了點擊化學(xué)、磁性捕獲、納米自組裝以及PET成像等重要的研究手段，分別對牛蒡子苷元的組織分布、細胞定位、以及靶點蛋白捕獲以及桔梗引甘草上行的機制等進行了研究，初步建立了篩選和鑒定細胞內(nèi)的靶點蛋白，并通過生物信息學(xué)分析、分子對接和基于結(jié)構(gòu)的計算分析手段確證相應(yīng)的靶標蛋白及其生物學(xué)功能，以及開展