牛蒡子苷分離、純化及其對實驗性糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細胞保護機制的初步探討.pdf

1、目的：研究牛蒡子的化學成分，分離純化牛蒡子苷，并初步探討牛蒡子苷對實驗性糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細胞損傷的保護機制。 方法：(1)采用硅膠柱層析、聚酰胺層析、LH-20等方法對牛蒡子的化學成分進行研究；(2)采用正交實驗設(shè)計方法，以牛蒡子苷為指標，確定了牛蒡子乙醇回流提取的最佳工藝；對10種類型大孔吸附樹脂進行篩選，篩選出對牛蒡子苷吸附效果最佳的樹脂；采用硅膠柱層析法，對牛蒡子苷進一步分離純化；(3)建立實驗性糖尿病大鼠模型，以GLU

2、、TC、TG、HDL-ch、LDL-ch、TB、ALB、BUN、CREA、GHbAlc、NO、SOD、ET、M=DA和尿液中TB、ALB為指標，研究牛蒡子苷藥理活性；(4)以差速消化法純化Wistar大鼠的主動脈內(nèi)皮細胞(RAECs)并進行傳代培養(yǎng)，測定牛蒡子苷對高糖條件下RAECs活性、RAECs釋放LDH、MDA和No的變化以及RAECs表達內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達的影響。 結(jié)果：(1)對牛蒡子的化學成分進行研究，

3、共分得12個單體化合物，并應(yīng)用光譜法(<'1>H-NMR、<'13>C-NMR、DEPT)，確定了全部12個化合物的結(jié)構(gòu)，分別為牛蒡子苷元(arctigenin，1)、羅漢松脂素(matairesinol，2)、牛蒡酚B(1appaol B，3)、牛蒡酚A(1appaolA，4)、牛蒡酚F(1appaol F，5)、牛蒡子苷(arctiin，6)、8-羥基松脂素(8-hydroxypinoresinol，7)、(+)-秦皮樹脂醇((+)

4、-Fraxiresinol，8)、無梗五加苷B(acanthoside B，9)、山萘酚(kaempferol，10)、槲皮素(quercetin，11)和異槲皮素(isoquercitrin，12)；(2)采用正交實驗設(shè)計方法，以牛蒡子苷為指標，確定了牛蒡子乙醇回流提取的最佳工藝為乙醇濃度70％，回流3次，回流時間1h，加8倍溶劑量。其次，以牛蒡子苷為指標，HPLC檢測，通過對大孔吸附樹脂進行靜態(tài)和動態(tài)的吸附-洗脫實驗，系統(tǒng)篩選了10

5、種大孔吸附樹脂，篩選出最佳樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂；并對最佳樹脂吸附一洗脫牛蒡子醇提液的工藝進行了實驗研究，確定了分離富集工藝為：上樣藥液濃度控制為5.5mg/mL，上樣流速控制為2BV/h，柱徑高比控制為1：5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度1BV/h；再換以4BV50％乙醇洗脫，醇洗速度2BV/h，收集50％醇洗液，濃縮干燥即得。經(jīng)過AB-8型大孔吸附樹脂處理后，牛蒡子苷固含量達到50％以上，最后，采用硅膠柱層析法，氯仿：甲醇(9：

6、1)洗脫進行純化，經(jīng)HPLc檢測，牛蒡子苷的含量達到90％以上；(3)牛蒡子苷各劑量組對實驗性糖尿病大鼠血液中GLU、GHbAlc濃度影響不顯著，牛蒡子苷醇提物組能降低GLU、GHbAlc濃度；牛蒡子苷各劑量組及其醇提物組均能降低實驗性糖尿病大鼠血液中的TC、TG、LDL-ch、ALB、BUN、CREA、ET、MDA水平，降低糖尿病大鼠尿總蛋白、尿白蛋白排泄量；同時，升高糖尿病大鼠血液中的HDL-ch、NO、SOD水平；(4)牛蒡子苷在

7、低劑量組時，對內(nèi)皮細胞生長無影響，隨著藥物濃度升高，牛蒡子苷對內(nèi)皮細胞有一定抑制作用，且有一定劑量依賴性；在一定濃度下(1μg·ml<'-1>、10μg·ml<'-1>及100μh·ml<'-1>)下，牛蒡子苷呈劑量依賴性的顯著減少高糖誘導(dǎo)的LDH、ET和MDA釋放；顯著增加高糖條件下內(nèi)皮細胞分泌NO的能力；增加高糖條件下內(nèi)皮細胞eNOS的表達。 結(jié)論：(1)牛蒡子的醇提物部分主要是木脂素類化學成分，其中牛蒡苷含量最高；(2)建