人早孕因子表達與促細胞生長模型的初步建立.pdf

1、早孕因子(early pregnancy factor, EPF)是哺乳動物妊娠早期母體血清中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子。具有免疫抑制和生長調節(jié)兩種功能，為目前最早確認妊娠的生化指標之一。小鼠受精后6h，豬、牛、山羊24h，人受精48h即可從母體內測出EPF，這些遠早于人絨毛膜促性腺激素(hCG)測定，而且EPF的活性可以在妊娠期存在很長時間，因此對EPF的活性檢測可用于牛、馬的早期妊娠診斷。EPF在孕婦的超早孕診斷中準確率達88.6％

2、，因此，EPF在早孕診斷方面的應用，將對人類及畜牧業(yè)有重要的意義。
　　 為獲得人早孕因子重組蛋白，提取人肝癌SMMC-7721細胞總RNA，對早孕因子基因進行RT-PCR擴增、TA克隆和測序，通過PCR技術擴增人早孕因子基因，克隆入原核表達載體pGEX-6p-1和pET-28a，分別與GST基因和his基因相融合，構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌表達菌株BL21，經(jīng)異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，以SDS-PAG

3、E和Western blot分析重組蛋白的表達，通過GST樹脂和純化表達蛋白。結果成功構建重組表達質粒pGEX6p-EPF，在大腸桿菌中誘導表達了GST-EPF融合蛋白，表達蛋白分子量為37.3kDa，并能被抗GST單克隆抗體特異識別，通過GST親和層析純化，制備得到EPF重組蛋白，pET28-EPF重組質粒成功構建，在大腸桿菌中誘導表達了his-EPF融合蛋白，表達蛋白分子量為17kDa，并能被抗his單抗特異識別，通過鎳柱純化得蛋白