基于AngⅡ上調(diào)p38MAPK通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與無患子皂苷降壓作用及機(jī)制的相關(guān)性研究.pdf

1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明:高血壓是一種慢性低級(jí)別炎癥性疾病,炎癥因素在原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸中扮演著極其重要的角色。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)存在于多種生物的細(xì)胞內(nèi),是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與心肌及血管平滑肌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及心肌肥厚等多種生理病理過程,其活化或抑制對(duì)心肌肥厚、血管重構(gòu)的發(fā)展或逆轉(zhuǎn)起著

2、重要作用。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)既是循環(huán)分泌系統(tǒng),又是局部分泌系統(tǒng),是血壓最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一,其主要效應(yīng)由血管緊張素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ, AngⅡ)及其特異性1型受體(angiotensin type1 receptor,ATlR)介導(dǎo),當(dāng)信號(hào)分子AngⅡ激活其受體ATlR后可上調(diào)p38MAPK表達(dá),從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展,

3、加重高血壓的病理進(jìn)程及靶器官的損害。p38MAPK下游的分子包括多種蛋白激酶、磷脂酶及轉(zhuǎn)錄因子,通過磷酸化這些分子使它們活化,繼而激活作用于下游的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)等,調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB是調(diào)節(jié)黏附因子如血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule1, VCAM-1)、細(xì)胞間粘附因子(intercellular a

4、dhesion molecule-1,ICAM-1),化學(xué)介質(zhì)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1),炎癥因子如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-а,TNF-α)等表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、AngⅡ依賴性內(nèi)皮損傷、細(xì)胞增殖及血

5、管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有重要的關(guān)系。
　　中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為:原發(fā)性高血壓的發(fā)生與氣血失和、痰濕內(nèi)蘊(yùn)、陰陽(yáng)失調(diào)、絡(luò)脈損傷等病機(jī)有關(guān)。在慢性低度炎癥過程中,損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可釋放大量活性物質(zhì),如炎癥因子IL-1、IL-6、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、ICAM-1、TNF-α、交感神經(jīng)兒茶酚胺(catecholamine,CA)類遞質(zhì)、縮血管因子AngⅡ、內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)、血栓素A

6、2(thromboxane A2,TXA2),擴(kuò)充血容量物質(zhì)醛固酮(Aldosterone,ALD),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等,這與中醫(yī)所述病理性津液滯留所致“痰”的理論一致。而慢性炎癥過程中血小板黏附、聚集及血栓的產(chǎn)生、纖維斑塊及結(jié)締組織的形成、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?/p>

7、細(xì)胞在內(nèi)皮下的沉積、血液粘稠度增高等現(xiàn)象,又符合中醫(yī)“瘀”的具體表現(xiàn)?！疤怠迸c“瘀”常共同致病,“毒”損心絡(luò),加重高血壓靶器官心臟的損傷。因此“祛痰化瘀通心絡(luò)”的中醫(yī)理論是治療高血壓的新途徑。
　　無患子皂苷(sapindus saponin,Sap)是從無患子科植物無患子樹的種子無患子假種皮中提取的有效部位,《本草拾遺》、《本草綱目》記載:性味、苦平,具有清熱、祛痰、消積、殺蟲之功效,可用于治療喉痹、腫痛、咳喘、白帶、瘡癬、腫毒

8、等癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,無患子皂苷具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛多種等藥理學(xué)活性,本課題組前期研究表明無患子皂苷可降低腎性高血壓模型大鼠的血壓,改善其左心室做功,對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠炎癥反應(yīng)也有一定的抑制作用?；谝陨习l(fā)現(xiàn),我們提出“無患子皂苷‘祛痰化瘀通心絡(luò)’中醫(yī)理論的細(xì)胞分子機(jī)制是對(duì)AngⅡ上調(diào)p38MAPK信號(hào)通路所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到調(diào)控作用”的假說。
　　目的：通過研究無患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously

9、hypertensive rats, SHR)的降壓效果以及對(duì)靶器官的保護(hù)作用,觀察其藥效學(xué)的量-效關(guān)系及時(shí)-效關(guān)系;通過觀察無患子皂苷對(duì)AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮、心肌炎癥反應(yīng)以及對(duì)內(nèi)皮損傷、心肌肥厚的影響,探討“祛痰化瘀通心絡(luò)”中醫(yī)降壓理論的細(xì)胞分子機(jī)制,為傳統(tǒng)的中醫(yī)理論尋找生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.無患子皂苷的藥效學(xué)研究
　　取A批SHR40只,隨機(jī)均分為5組,即SHR模型組、卡托普利(c

10、aptopril, Cap,27 mg·kg-1)組、Sap27 mg·kg-1、54 mg·kg-1、108 mg·kg-1劑量組,另取8只健康WKY大鼠作為正常對(duì)照組,按劑量連續(xù)給藥8周,檢測(cè)指標(biāo)如下:①對(duì)SHR一般狀態(tài)的影響;②單次給藥對(duì)血壓值的影響;③連續(xù)給藥對(duì)血壓值的影響;③對(duì)左心室重量指數(shù)(left ventricular weight index,LVMI)的影響;④ HE及Masson染色觀察對(duì)心、腦、腎、主動(dòng)脈血管的組

11、織形態(tài)學(xué)的影響。
　　2.無患子皂苷降壓機(jī)制研究
　　A批大鼠內(nèi)皮功能檢查:①對(duì)胸主動(dòng)脈血管對(duì)于不同血管收縮劑 AngⅡ(10-9 mol· L-1~10-5 mol· L-1)、苯腎上腺素( phenylephrine, PE)(10-8 mol· L-1~10-4 mol· L-1)、KCl(20 mmol· L-1~120 mmol· L-1)收縮反應(yīng)性的影響;②對(duì)乙酰膽堿(acetylcholine chloride

12、,Ach)(10-10 mol·L-1~10-5 mol·L-1)血管內(nèi)皮依賴性及硝普鈉(sodium nitroprusside dihydrate,SNP)(10-8 mol·L-1~10-3 mol·L-1)非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)的影響;③ Elisa法檢測(cè)對(duì)血管活性物質(zhì)一氧化氮(nitric oxide, NO)、6-酮-前列腺素1α(6-keto–prostacyclin1α,6-KPG1а)、ET-1、TXB2血清含量的影

13、響。
　　另取B批SHR32只,舍去Sap54 mg·kg-1劑量組,其余分組及給藥同上,檢測(cè)指標(biāo)如下:④ Elisa法檢測(cè)對(duì)交感神經(jīng)遞質(zhì) CA類血漿含量的影響;⑤ Elisa法檢測(cè)對(duì)RAAS活性物質(zhì)血漿腎素活性(plasma renin activity, PRA)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)、AngⅡ及ALD血漿含量的影響;⑥對(duì)AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的血管內(nèi)

14、皮炎癥反應(yīng)的影響:Elisa法檢測(cè)主動(dòng)脈血管組織勻漿AngⅡ的含量,RT-PCR法檢測(cè)AT1RmRNA的基因表達(dá),Western-blot法檢測(cè)主動(dòng)脈p-p38MAPK的蛋白表達(dá),免疫組化法檢測(cè)血管細(xì)胞炎癥因子ICAM-1、TGF-β1及VEGF的蛋白表達(dá),放免法檢測(cè)血清炎癥因子IL-1,IL-6及TNF-α含量;⑦對(duì)AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)的影響:Elisa法檢測(cè)心肌勻漿AngⅡ的含量,免疫組化法檢測(cè)心肌組織AT

15、1R的蛋白表達(dá)情況,免疫組化法檢測(cè)心肌組織NF-κB的蛋白表達(dá),western-blot法檢測(cè)心肌組織p-p38MAPK的蛋白表達(dá)情況,Elisa法檢測(cè)心肌勻漿hs-CRP含量,免疫組化法檢測(cè)心肌組織TGF-β1及VEGF的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.藥效學(xué)研究結(jié)果
　　1.1模型大鼠病理變化
　　SHR進(jìn)食量減少、體重減輕,血壓隨著鼠齡增長(zhǎng),心、腦、腎、血管出現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷,上述指標(biāo)與正常對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)

16、前比較均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
　　1.2無患子皂苷降壓效果及對(duì)及靶器官的保護(hù)作用
　　無患子皂苷具有以下作用:① Sap27、54、108 mg· kg-1劑量組可增加SHR進(jìn)食量及體重,改善其行為學(xué)一般狀態(tài);②單次藥后30min即表現(xiàn)出降壓效果,藥效可持續(xù)至藥后240min;③連續(xù)給藥8周期間,血壓值持續(xù)降低,Sap27 mg·kg-1降壓作用有一定的波動(dòng),但Sap54、108 mg·kg-1降壓效

17、果較為平穩(wěn);④可改善高血壓靶器官的病理?yè)p傷狀態(tài):逆轉(zhuǎn)心肌肥厚及心室重構(gòu),改善腦皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)血管及神經(jīng)元病變,抑制腎小球的肥大或萎縮,保護(hù)主動(dòng)脈血管內(nèi)皮、抑制中膜平滑肌的增殖等,上述指標(biāo)與 SHR模型組或用藥前比較均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
　　2.降壓機(jī)制研究結(jié)果
　　2.1模型大鼠病變機(jī)制
　　研究發(fā)現(xiàn),自發(fā)性高血壓大鼠表現(xiàn)為:①內(nèi)皮損傷、功能失衡,表現(xiàn)為主動(dòng)脈環(huán)對(duì)AngⅡ(10-9 mol·L

18、-1~10-5 mol·L-1)、PE(10-8 mol·L-1~10-4 mol·L-1)、KCl(20 mmol·L-1~120 mmol·L-1)誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng);②對(duì)Ach(10-10 mol·L-1~10-5 mol·L-1)誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)減弱,而對(duì)SNP(10-8 mol·L-1~10-3 mol·L-1)誘發(fā)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)未見明顯變化;③血清TXB2,ET-1含量增加,而NO,6-k-PGF1a含

19、量減少;④交感神經(jīng)及RAAS活性物質(zhì)增強(qiáng): CA,PRA,ACE, AngⅡ及ALD的血漿含量升高;⑤ AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)增強(qiáng):使血管組織AngⅡ含量增加, AT1R基因表達(dá)增加,促進(jìn)血管細(xì)胞內(nèi)p-p38MAPK蛋白表達(dá),使炎癥因子ICAM-1、TGF-β1,VEGF在血管的蛋白表達(dá)增加,hs-CRP,IL-1, IL-6及TNF-α的釋放增加;⑥ AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)增強(qiáng):心肌

20、AngⅡ含量增加,心肌細(xì)胞內(nèi)AT1R蛋白表達(dá)增加,使p-p38MAPK蛋白表達(dá)增加,進(jìn)而促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的蛋白表達(dá),使炎癥因子CRP在心肌組織含量增加,TGF-β1,VEGF在心肌的蛋白表達(dá)水平升高,上述指標(biāo)與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
　　2.2無患子皂苷對(duì)SHR內(nèi)皮損傷及心肌肥厚的保護(hù)機(jī)制
　　無患子皂苷可逆轉(zhuǎn)SHR上述病理變化,表現(xiàn)為:① Sap可抑制主動(dòng)脈對(duì)PE、AngⅡ、KC

21、l的收縮反應(yīng);②增強(qiáng)對(duì)Ach的內(nèi)皮依賴性舒張效應(yīng),對(duì)SNP非內(nèi)皮依賴性舒張效應(yīng)未見明顯影響;③降低血清 TXB2,ET-1含量,增加 NO,6-k-PGF1a含量;④抑制交感神經(jīng)及RAAS活性:降低血漿CA,PRA、ACE、AngⅡ及ALD含量;⑤抑制AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng):降低血管組織 AngⅡ含量,抑制AT1R的基因表達(dá),抑制p-p38MAPK的蛋白表達(dá),使其表達(dá)產(chǎn)物ICAM-1, TGF-β1,VEGF

22、,hs-CRP,IL-1,IL-6及TNF-α的釋放減少;⑥抑制AngⅡ/p38MAPK通路誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng):抑制信號(hào)分子AngⅡ在心肌組織的含量,抑制其特異性受體AT1R的蛋白表達(dá),抑制心肌p-p38MAPK的蛋白表達(dá),使其表達(dá)產(chǎn)物hs-CRP, TGF-β1及 VEGF釋放減少,上述指標(biāo)與 SHR對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.無患子皂苷對(duì) SHR有顯著的降壓作用,對(duì)高血壓靶器官