髓系惡性腫瘤始動細胞拮抗氧化應激誘導的細胞衰老的實驗研究.pdf

1、第一部分不同危險程度骨髓增生異常綜合征患者CD34+細胞差異性表現(xiàn)衰老特征
　　目的:評估骨髓增生異常綜合征(MDS)患者CD34+細胞的衰老表現(xiàn)和程度,探討這種衰老現(xiàn)象與氧化應激-DNA損傷-p38MAPKα(p38)信號通路激活的關系。
　　方法:從47例MDS患者,14急性髓系白血病(AML)患者和12例健康志愿者的骨髓細胞中分選出CD34+細胞,檢測衰老相關β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色和細胞周期依賴性蛋白激酶

2、抑制因子p21CIP1/WAF1(p21)的表達水平來評價這群細胞的衰老表現(xiàn),分別用流式細胞術、細胞免疫熒光、蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)、DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX和p38的表達水平。
　　結果:與正常對照相比,不論是骨髓單個核細胞(BMMNCs)群體還是CD34+細胞,SA-β-gal染色陽性細胞數(shù)比例和p21的基因表達在相對低危組(lower-risk)MDS組均明顯增高(P<0

3、.01),SA-β-gal染色陽性細胞數(shù)比例與患者國際預后積分系統(tǒng)(IPSS)呈負相關;ROS積聚和γ-H2AX陽性細胞比例在BMMNCs、CD34+細胞水平各組之間無統(tǒng)計學差異,但兩者在CD34+CD38-細胞水平呈相互關聯(lián)性升高(P<0.05),對照組　　

4、結論:在包含干/祖細胞或MDS始動細胞的CD34+細胞群體,MDS相對低危組患者有明顯增多的衰老細胞,這在無效造血或抵抗轉(zhuǎn)化白血病方面可能起到一定作用,而此作用不完全依賴于ROS-p38信號通路;而MDS相對高危組患者的CD34+細胞沒有明顯衰老表現(xiàn),表明其突破了阻礙其向AML轉(zhuǎn)化的衰老屏障。
　　第二部分P38MAPKα低水平磷酸化阻礙髓系白血病CD34+CD38-細胞氧化應激誘導的細胞衰老
　　目的:研究髓系白血病CD3

5、4+CD38-細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)-DNA損傷-P38MAPKα(p38)-細胞衰老這一在造血干細胞(HSCs)中的經(jīng)典應激性衰老通路的信號分子激活情況。
　　方法:從11例急性髓系白血病(AML)患者、9例慢性髓系白血病(CML)慢性期患者骨髓單個核細胞和KG1a、K562細胞系中分選出CD34+CD38-細胞,比較它們與正常臍血CD34+CD38-細胞的ROS-DNA損傷-p38-細胞衰老信號通路激活情況。以KG1a、K5

6、62細胞系的CD34+CD38-細胞為研究對象,異常激活p38,觀察它們的細胞增殖、周期、衰老、凋亡的變化。
　　結果:髓系白血病患者和KG1a、K562細胞系CD34+CD38-細胞的ROS聚積和DNA雙鏈斷裂標志物γ-H2AX水平明顯高于正常臍血HSCs和用H2O2刺激而誘導衰老的臍血HSCs,而p38的磷酸化水平卻相對不足;迫使KG1a、K562細胞系CD34+CD38-細胞的p38高水平磷酸化后,細胞發(fā)生衰老樣改變、細胞周

7、期阻滯和凋亡。
　　結論:在包含髓系白血病始動細胞的CD34+CD38-群體中,p38磷酸化水平的相對不足,是解聯(lián)細胞內(nèi)ROS聚積誘導細胞衰老和/或凋亡的重要原因。
　　第三部分MicroRNA-34c誘導髓系白血病CD34+CD38-細胞衰老樣改變
　　目的:研究miR-34c在髓系白血病CD34+CD38-細胞中的表達,它是否能誘導細胞衰老,是否受ROS-p38信號調(diào)控及其在髓系白血病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　

8、方法:從11例急性髓系白血病(AML)患者、9例慢性髓系白血病(CML)慢性期患者骨髓單個核細胞和KG1a、K562細胞系中分選出CD34+CD38-細胞,用實時定量RT-PCR檢測miR-34c的表達水平;用p38激活劑使KG1a、K562細胞系CD34+CD38-細胞的p38高水平磷酸化,觀察miR-34c表達水平的變化;用miR-34c的類似物轉(zhuǎn)染KG1a、K562的CD34+CD38-細胞,使其高水平表達miR-34c,觀察細胞

9、增殖、周期、衰老、凋亡的變化和其下游靶蛋白的表達水平變化;運用KG1a-AML-NOD/SCID小鼠模型,通過觀察小鼠的體重變化,生存狀態(tài)、腫瘤負荷,研究miR-34c在AML發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結果:與正常臍血CD34+CD38-細胞相比,髓系白血病患者和KG1a、K562細胞系CD34+CD38-細胞的miR-34c的表達明顯下降;KG1a、K562細胞系CD34+CD38-細胞的miR-34c表達隨p38的磷酸化而增強;

10、轉(zhuǎn)染miR-34c類似物后,通過下調(diào)多種下游靶蛋白(e2f3,cyclin-E,c-myc,CDK4)使KG1a、K562細胞系CD34+CD38-細胞呈現(xiàn)衰老樣改變和細胞凋亡;miR-34c類似物注入KG1a-AML-NOD/SCID小鼠模型后能使小鼠的生存時間延長,腫瘤負荷減輕,從而阻礙AML的發(fā)生發(fā)展。
　　結論:miR-34c是誘導髓系白血病CD34+CD38-細胞衰老樣改變的重要小分子,它在髓系白血病中的低水平表達是白血