苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒ac130(gp16)和ac132的功能研究.pdf

1、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV) orf130(ac130，gp16)和orf132(ac132)位于該基因組上由五個同向基因形成的基因簇中（orf129-133）。ac130編碼一個分子量為16kDa的糖蛋白。其同源基因存在于所有已完成測序的Ⅰ組和大多數(shù)Ⅱ組α-桿狀病毒中。ac132的同源基因存在于所有已完成測序的Ⅰ組α

2、-桿狀病毒中。這兩個基因在桿狀病毒復制周期中的作用尚未明了。本文對ac130和ac132及其編碼的蛋白質(zhì)的分子生物學特征和在病毒復制中的功能進行了研究分析。
　　利用λ-Red同源重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)從AcMNPV基因組敲除gp16，獲得gp16缺失突變體并構建gp16異位回復突變體。分別用gp16缺失、缺失回復突變體和野生型病毒轉(zhuǎn)染和感染Sf9細胞，比較分析gp16缺失突變體病毒在培養(yǎng)細胞中的復制特征和表型變化。實

3、驗結果顯示，gp16缺失突變體在受感染細胞中的增殖曲線和芽殖型病毒體(budded virus，BV)產(chǎn)量與gp16回復突變體和野生型病毒沒有顯著差異。對分別被gp16缺失、回復突變體和野生型病毒感染的細胞在不同時間點取樣進行Real-time PCR分析的實驗結果表明，gp16缺失對病毒基因組DNA復制沒有影響。利用AcMNPV VP39和多角體蛋白特異性抗體，對gp16缺失和回復突變體病毒感染細胞的蛋白進行SDS-PAGE和west

4、ern-blot分析的實驗結果顯示，兩種病毒感染細胞在各個對應時間點的蛋白質(zhì)樣品中的VP39和多角體蛋白表達量無顯著差異，表明gp16缺失對晚期基因表達沒有顯著影響。對gp16缺失和回復突變體病毒感染Sf9細胞的超薄切片電子顯微鏡觀察結果表明，gp16缺失突變體在受感染細胞中的形態(tài)發(fā)生過程與野生型和缺失回復突變體相似。這些實驗結果表明，gp16是病毒復制非必需基因。
　　用gp16缺失突變體、gp16回復突變體和野生型病毒包涵體感

5、染甜菜夜蛾三齡幼蟲的生物測定實驗結果顯示，gp16缺失突變體病毒的半數(shù)致死劑量與野生型和gp16回復突變體病毒沒有顯著差異，但半數(shù)生存時間比野生型和gp16回復突變體延長至少6h。
　　據(jù)早期研究報道，黃杉毒蛾核多角體病毒（Orgyia Pseudotsugata multiplenucleopolyhedrovirus，OpMNPV）GP16定位于受感染細胞核膜周圍的片層膜狀結構。在本研究中，我們構建了gp16啟動子控制的表達G

6、P16-EGFP融合蛋白的重組病毒對GP16進行亞細胞定位分析。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，GP16-EGFP融合蛋白在受感染的Sf9細胞中聚集于靠近核膜周圍。在AcMNPV感染Sf9細胞的亞細胞組分分離實驗中，GP16蛋白存在于細胞質(zhì)的輕膜部分。對受感染細胞超薄切片的電鏡觀察顯示，子代核衣殼穿過核膜時形成許多跨越核膜并包裹核衣殼的囊泡。綜合上述實驗結果，推測GP16可能定位于受感染細胞的高爾基體，參與核衣殼的出核和/或在細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運過

7、程。
　　同樣利用λ-Red重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別構建敲除orf129-132以及單獨敲除ac132的AcMNPV突變體。鑒于以往的研究報道和本文的前述研究結果顯示orf129、orf131和gp16對病毒復制是非必需的，我們分別在orf129-132缺失和ac132單獨缺失突變體的基礎上構建了ac132異位回復突變體，研究ac132對病毒復制的作用。轉(zhuǎn)染和感染實驗結果顯示，用orf129-132缺失和ac132單

8、獨缺失突變體bacmids轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)上清液接種的新細胞培養(yǎng)中只出現(xiàn)個別被感染的細胞;而兩種ac132回復突變體bacmids均能在被轉(zhuǎn)染細胞中復制出感染性病毒;所產(chǎn)生的子代病毒的生長曲線與野生型病毒生長曲線相似。此結果表明ac132對病毒正常復制是必需的。
　　利用AcMNPV VP39和E25蛋白特異性抗體，對ac132缺失和回復突變體bacmids轉(zhuǎn)染細胞的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE和western-blot分析的實驗結果

9、顯示，兩種bacmids轉(zhuǎn)染細胞在各個對應時間點的蛋白質(zhì)樣品中的VP39和E25表達量無顯著差異，表明ac132缺失對晚期基因表達沒有顯著影響。ac132缺失突變體和缺失回復突變體轉(zhuǎn)染細胞的超薄切片電鏡照片顯示，ac132缺失突變體轉(zhuǎn)染的細胞核中病毒發(fā)生基質(zhì)和包涵體出現(xiàn)的時間較缺失回復突變體轉(zhuǎn)染細胞延遲;有囊膜的核衣殼數(shù)量減少;包涵體中的病毒粒子主要以單粒包埋為主。
　　從AcMNPV感染的細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解物分別純化BV和

10、病毒包涵體，從包涵體中純化多角體源性病毒體(occlusion-derived virus，ODV)，分別從BV和ODV分離囊膜和核衣殼組分。對BV和ODV囊膜和核衣殼組分的SDS-PAGE和western-blot分析結果顯示，AC132同時存在于BV和ODV核衣殼組分，未見于囊膜組分;表明AC132是BV和ODV共有的核衣殼蛋白。從病毒體組分中檢測到的AC132大小約28 kDa。
　　利用SDS-PAGE和western-b

11、lot分析AC132在受感染細胞中的表達時程的實驗結果顯示，AC132條帶最早見于感染后12h的細胞裂解物中，在感染細胞后24h的細胞中達到最大量。
　　對AcMNPV感染的Sf9細胞的免疫熒光-共聚焦顯微鏡實驗分析結果顯示AC132最早見于病毒感染后12h，主要分布在細胞質(zhì)中，也有極少量以斑點狀存在于細胞核中心區(qū);在24h時，主要分布在細胞核中，在細胞核的邊緣呈環(huán)形分布;在72h時，僅見于細胞核中。
　　為了進一步探究AC