大麻素CB2受體通路拮抗內(nèi)毒素休克的作用及機制.pdf

1、研究背景及目的：
　　 感染性休克是由病原微生物感染引起的以發(fā)熱、寒戰(zhàn)、四肢濕冷、皮膚紫紺、心動過速、低血壓為主要臨床癥狀及體征的綜合征，常伴多臟器功能衰竭，是臨床上常見的死亡率高的危重病癥。臨床上以革蘭氏陰性細菌感染最為常見。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)也稱內(nèi)毒素，可以刺激血液及組織中單核-巨噬細胞釋放多種細胞因子。這些炎癥介質(zhì)啟動體內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導致感染性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemi

2、cinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)、多器官功能衰竭，甚至死亡。因此，感染性休克又稱之為內(nèi)毒素休克。目前治療感染性休克的措施有很多，包括補充血容量、糾正酸中毒、改善微循環(huán)、控制感染及抑制炎癥介質(zhì)的釋放。其中抑制炎癥介質(zhì)的釋放有利于控制全身炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)障礙及代謝紊亂，阻止多器官功能衰竭，在抗休克治療中具有重要作用。事實上，在臨床上感染性休克缺乏有效的治療，因此，尋找有效治療感染性休克的新藥極為重要

3、。
　　 大麻是一種古老的植物。早在數(shù)千年前，大麻作為麻醉品廣泛使用。盡管大麻具有止痛、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用，但因成癮性，其使用受到嚴格限制。大麻素(cannabinoid，CB)是大麻的主要活性成分。近年來，研究發(fā)現(xiàn)大麻素除了具有大麻的止痛、鎮(zhèn)靜的藥理作用外，還能調(diào)節(jié)食欲、調(diào)節(jié)脂肪代謝、調(diào)節(jié)血壓及調(diào)節(jié)免疫，且對心臟及神經(jīng)具有保護作用。研究也發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在兩種CB受體，即CB1受體和CB2受體。大麻素通過作用于CB受體發(fā)揮上述作用。

4、CB1受體主要分布在腦、脊髓與外周神經(jīng)系統(tǒng)中，與記憶、認知、成癮性、運動控制有關(guān)；CB2受體在免疫組織中有豐富的表達，介導免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 研究者就大麻素對免疫的調(diào)節(jié)進行了大量的研究，多數(shù)研究顯示大麻素具有免疫抑制作用，少數(shù)研究提示大麻素促進免疫反應(yīng)。大麻素對免疫的調(diào)節(jié)大致可分為四個途徑，即：(1)誘導細胞凋亡；(2)抑制細胞增殖和分化；(3)抑制細胞因子和趨化因子的生產(chǎn)；(4)誘導調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)。
　　

5、 細胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。凋亡包括細胞形態(tài)(如細胞縮小、核碎裂染等)和分子(如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspases和細胞色素)的改變。大麻的主要活性成分四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol，THC)屬于非選擇性CB受體激動劑，通過CB1和CB2受體發(fā)揮作用。研究證實THC能促進脾細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)THC的這種促凋亡作用與Bcl-2和casp

6、ase-1活性的改變有關(guān)；非選擇性CB受體激動劑大麻二酚也可通過增強反應(yīng)性氧化物的生成和caspase-3和8的活性誘導CD4+和CD8+T細胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)大麻素抑制細胞凋亡。選擇性CB2受體激動劑JWH-015除了抑制T淋巴細胞凋亡，還能抑制B淋巴細胞和胸腺細胞的凋亡，并且深入研究發(fā)現(xiàn)caspase-3、8和9參與細胞的凋亡。這些研究說明大麻素可改變caspases的活性及氧化物的生成，進而調(diào)節(jié)細胞凋亡。
　　 研究者發(fā)現(xiàn)

7、非選擇性CB受體激動劑anandamide和選擇性CB2受體激動劑JWH-015抑制T和B淋巴細胞增殖，但是也有研究者發(fā)現(xiàn)小劑量的非選擇性CB受體激動劑CP55940、WIN55212-2和△9THC能促進人扁桃體B淋巴細胞的增殖。且CP55940的促增殖作用能被選擇性CB2受體拮抗劑SR144528抑制，卻不能被CB1受體拮抗劑SR141716A阻斷。此外，2-arachidonylglycerol(2-AG)能誘導HL-60細胞分化

8、巨噬細胞樣細胞，并且SR144528能抑制非選擇性CB受體激動劑2-AG的這種誘導分化作用。這些研究提示大麻素雙向調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖和分化，且CB2受體可能介導該免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 大量研究還發(fā)現(xiàn)大麻素調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)的生成。例如，大麻的主要活性成分THC抑制人的B細胞產(chǎn)生IL-8和巨噬細胞炎性蛋白-1(macrophageinflammatoryprotein，MIP-1)；抑制NK細胞產(chǎn)生TNF-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺

9、激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)、干擾素-γ(interferon，IFN-γ)、MIP－1α、MIP－1β和IL－10；抑制嗜酸性粒細胞產(chǎn)生IL－8、MIP－1α和MIP－1β。在嗜肺軍團病桿菌感染模型中，THC可抑制Th1細胞因子IFN-γ及IL-12的生成，促進Th2細胞因子IL-4和IL-10的生成，致使Th細胞的分化向Th2細胞偏移，促進Th2細

10、胞輔助的體液免疫應(yīng)答。在LPS誘導的發(fā)熱模型中，非選擇性CB受體激動劑WIN55212-2能降低該模型小鼠的血清IL-6水平，并且能緩解LPS誘導的發(fā)熱。這些研究提示大麻素能抑制炎癥因子的生成。在非致死劑量嗜肺性軍團桿菌感染模型中，THC可促進急性期炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，研究提示THC能促進炎癥因子的生成。
　　 大麻素雖具有多種藥理作用，但因其成癮性，其臨床應(yīng)用受到一定限制。選擇性CB2受體激動劑能特異性結(jié)合CB

11、2受體，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而又無成癮性，是一類非常有臨床應(yīng)用前途的化合物。在組織損傷模型中，選擇性CB2受體激動劑HU-308不僅能抑制趨化因子單核細胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein，MCP-1)、TNF-α、IL-1β和細胞黏附分子-1(intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM-1)在腎臟組織的表達，減少順鉑對腎臟的損傷；還能抑制小鼠血清及腎臟組織中生成TNF

12、-α、MCP-1α和MCP-2，對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用。
　　 上述研究說明大麻素能夠調(diào)節(jié)炎癥過程中炎癥因子的生成。但炎癥因子相互調(diào)節(jié)、相互調(diào)控、相互影響，炎癥因子的調(diào)節(jié)極為復雜。一些研究提示大麻素抑制炎癥因子的生成，另一些研究提示大麻素促進炎癥因子的生成，大麻素具有促炎作用還是抑炎作用仍有爭議。本課題研究CB受體激動劑拮抗內(nèi)毒素休克的作用及機制。明確CB受體激動劑對內(nèi)毒素休克的調(diào)節(jié)及CB2受體是否參與內(nèi)毒素休克的調(diào)節(jié)

13、。
　　 研究方法：
　　 1、體內(nèi)實驗
　　 取體重約20～25g的雄性野生型小鼠(C57BL/6小鼠)和CB2-/-小鼠，腹腔注射LPS溶液，制備內(nèi)毒素休克模型。觀察野生型小鼠和CB2-/-小鼠內(nèi)毒素休克24h生存率。
　　 2、體外實驗
　　 (1)腹腔巨噬細胞的分離、培養(yǎng)與活化
　　 每只C57BL/6小鼠腹腔注射2ml/日的3％肉湯基，連續(xù)3天后引頸處死小鼠；在無菌條件下分離出小

14、鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)整細胞密度，接種細胞懸液至6孔板或96孔板(6孔板細胞密度為6×106/ml，96孔板細胞密度為2×106/ml)，在孵箱孵育2h后，1×PBS液洗滌一次，換液，置于孵箱過夜。
　　 (2)腹腔巨噬細胞的干預(yù)
　　 第5日將培養(yǎng)的腹腔巨噬細胞換液后，先加入不同濃度的非選擇性CB受體激動劑WIN55212－2或選擇性CB2受體激動劑HU-308，15min后再加入10ng/mlLPS。未予任何干預(yù)的腹腔巨

15、噬細胞作為陰性對照組；只予LPS的腹腔巨噬細胞作為陽性對照組。
　　 (3)細胞因子基因表達量的測定
　　 在加入10ng/mlLPS3h后，用Trizol裂解液裂解腹腔巨噬細胞，抽提總RNA。再將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用RT-PCR和實時定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測樣品中TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達量。
　　 (4)細胞因子蛋白表達量的測定
　　 在加入10ng/mlLP

16、S24h后，收集培養(yǎng)上清液，參照廠商說明書用ELISA檢測上清中IL-6蛋白的濃度。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)在LPS(15mg/kg)誘導的內(nèi)毒素休克模型中，野生型小鼠和CB2-/-小鼠均出現(xiàn)豎毛，眼淚分泌增多，腹瀉及行動遲緩等典型的休克癥狀，但CB-/-小鼠的休克癥狀更為嚴重。CB2-/-小鼠在腹腔注射LPS(15mg/kg)1h內(nèi)開始死亡，其24h生存率只有46.7％；腹腔注射LPS(15mg/kg)的野生型

17、小鼠沒有死亡，其24h生存率100％。該結(jié)果表明CB2受體通路具有降低LPS誘導的內(nèi)毒素休克死亡率，即提示CB2受體通路可能對內(nèi)毒素休克具有防治作用。
　　 (2)RT-PCR結(jié)果顯示，3μMWIN55212-2可顯著減少LPS活化的腹腔巨噬細胞表達促炎細胞因子TNF-αmRNA和IL-6mRNA的水平；0.3μMWIN55212-2可顯著增加LPS活化的腹腔巨噬細胞表達促炎細胞因子TNF-αmRNA和IL-6mRNA。qRT-

18、PCR結(jié)果進一步顯示，3μMWIN55212-2組的TNF-αmRNA表達量只有LPS陽性對照組的一半；0.3μMWIN55212-2組的TNF-αmRNA表達量比LPS陽性對照組高出1倍多，提示W(wǎng)IN55212-2能雙向調(diào)節(jié)LPS活化的腹腔巨噬細胞表達TNF-αmRNA。3μMWIN55212-2組表達IL-6mRNA只有LPS陽性對照組的1/3；0.3μM和1μMWIN55212-2組IL-6mRNA的表達明顯高于LPS陽性對照組，

19、0.3μMWIN55212-2組的IL-6mRNA表達量是LPS陽性對照組的約2.5倍，1μMWIN55212-2組的IL-6mRNA表達量是LPS陽性對照組的2倍，提示W(wǎng)IN55212-2也能雙向調(diào)節(jié)LPS活化的腹腔巨噬細胞表達IL-6mRNA。
　　 (3)ELISA結(jié)果示：3μMWIN55212-2組上清液中IL-6蛋白的含量只有LPS陽性對照組的1/3；0.3μM和1μMWIN55212-2組上清液中IL-6的含量明顯高

20、于LPS陽性對照組，0.3μM和1μMWIN55212-2組上清液中IL-6的含量分別是LPS陽性對照組的4、2倍，研究結(jié)果提示：WIN55212-2也能雙向調(diào)節(jié)LPS活化的腹腔巨噬細胞上清液中IL-6蛋白的含量。
　　 (4)HU-308對LPS活化的腹腔巨噬細胞生成的炎癥因子的調(diào)節(jié)與WIN55212-2一致，RT-PCR結(jié)果顯示，3μM和10μM的HU-308可顯著減少LPS活化的腹腔巨噬細胞表達促炎細胞因子TNF-α和IL

21、-6mRNA；0.3μM的WIN55212-2可顯著增加LPS活化的腹腔巨噬細胞表達TNF-α和IL-6mRNA。qRT-PCR結(jié)果進一步顯示，3μM和10μMHU-308組TNF-αmRNA的表達量明顯較LPS陽性對照組低，10μMHU-308組的TNF-αmRNA表達量只有LPS陽性對照組的1/3，3μMHU-308組的TNF-αmRNA表達量只有LPS組的1/2；0.3μMHU-308組的TNF-αmRNA表達量比LPS陽性對照組

22、高2倍，研究結(jié)果表明：HU-308能雙向調(diào)節(jié)LPS活化的腹腔巨噬細胞表達TNF-αmRNA。3μM和10μMHU-308組的IL-6mRNA表達量明顯低于LPS陽性對照組，3μM和10μMHU-308組表達的IL-6mRNA只有LPS陽性對照組的1/4，0.3μMHU-308組的IL-6mRNA表達量是LPS陽性對照組的約2倍。研究結(jié)果提示：HU-308也能雙向調(diào)節(jié)LPS活化的腹腔巨噬細胞表達IL-6mRNA。
　　 (5)EL

23、ISA結(jié)果示：0.3μMHU-308組上清液中IL-6的含量明顯高于LPS陽性對照組，0.3μMHU-308組上清液中IL-6的含量是LPS陽性對照組的約5倍；3μM和10μMHU-308組上清液中IL-6的含量只有LPS陽性對照組的1/3，研究結(jié)果提示：HU-308也能雙向調(diào)LPS活化的腹腔巨噬細胞上清液中IL-6蛋白的含量。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、CB2受體的完整性能減少LPS誘導的內(nèi)毒素休克的死亡率，提示CB