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文檔簡介
1、實(shí)驗(yàn)背景:胰安肽(aglycin)是從大豆種子中提取得到的含有37個(gè)氨基酸殘基的新生物肽,在鏈內(nèi)具有六個(gè)半胱氨酸,依次為鏈內(nèi)第3、7、15、20、22和32位氨基酸,該結(jié)構(gòu)不僅表現(xiàn)為穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì),而且還有廣泛的生理活性。對(duì)胰安肽前期研究結(jié)果顯示:胰安肽體外具有耐胃蛋白酶,胰蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶Glu-C(金黃色葡萄球菌V8蛋白酶)降解作用,同時(shí)體外具有保護(hù)胰腺β細(xì)胞的作用。本課題組對(duì)其體內(nèi)藥理活性進(jìn)行了一系列的篩選,結(jié)果顯示:胰安肽
2、對(duì)1型糖尿病小鼠血糖并無明顯的改善作用,而口服胰安肽卻對(duì)2型糖尿病小鼠具有降低血糖的作用。
研究目的:鑒于前期對(duì)胰安肽的藥理學(xué)篩選結(jié)果顯示胰安肽具有口服降低2型糖尿病小鼠血糖作用,以及改善胰島素抵抗和β細(xì)胞保護(hù)在2型糖尿病治療中的積極作用,本課題組將對(duì)口服胰安肽對(duì)2型糖尿病的作用及機(jī)制進(jìn)行研究。
研究方法:1.胰安肽體外對(duì)胰島素抵抗作用研究
建立HepG2細(xì)胞株高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型,MTT法檢測胰安
3、肽對(duì)正常和胰島素抵抗 HepG2細(xì)胞增殖的影響;檢測胰安肽對(duì)正常和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞在胰島素協(xié)同或不協(xié)同作用對(duì)葡萄糖消耗的影響,以及葡萄糖代謝中的重要酶葡萄糖激酶(GK),葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的活性變化,以及肝糖原含量的變化。研究胰安肽對(duì)胰島素敏感性相關(guān)的重要蛋白的影響;并通過
siRNA沉默IR,檢測胰安肽對(duì)葡萄糖消耗以及胰島素受體信號(hào)通路的影響。
2.胰安肽體外對(duì)高糖所致NIT-1細(xì)胞損傷
4、的保護(hù)作用研究
采用高糖環(huán)境誘導(dǎo)NIT-1細(xì)胞損傷,通過檢測細(xì)胞活力和胰島素分泌水平,研究胰安肽對(duì)NIT-1細(xì)胞的保護(hù)和促胰島素分泌作用。
3.胰安肽體內(nèi)降糖作用研究
采用高脂飼料喂養(yǎng)和腹腔注射STZ誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型,通過檢測血糖,總膽固醇,甘油三酯的水平,研究胰安肽降低血糖血脂的作用;通過檢測血清胰島素,口服糖耐量,胰島素耐受測試,研究胰安肽對(duì)葡萄糖的利用和改善胰島素敏感性的作用;通過檢測肌肉組織和
5、脂肪組織中果糖激酶(HK),蘋果酸脫氫酶(MDH),肝臟組織GK和G-6-Pase的活性的變化,研究胰安肽對(duì)外周組織重要葡萄糖代謝酶的影響;通過real-time PCR檢測肌肉、肝臟、脂肪組織胰島素受體信號(hào)通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的變化和 WB檢測肌肉組織蛋白及其磷酸化水平的變化,明確胰安肽對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響。
4.胰安肽口服吸收特點(diǎn)研究
采用HPLC檢測口服胰安肽后小鼠體內(nèi)胰安肽的濃度。
研究結(jié)果:1.胰
6、安肽體外對(duì)胰島素抵抗作用研究
胰安肽對(duì)正常和胰島素抵抗 HepG2細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用,在胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi),在加入或不加入胰島素刺激胰島素信號(hào)通路時(shí),胰安肽各劑量組對(duì)葡萄糖的攝取明顯高于模型對(duì)照組,且呈劑量依賴性。采用胰島素作用15 min后,激活胰島素信號(hào)通路,在胰島素的協(xié)同作用下,胰安肽能顯著性增加GK活性,降低G-6-Pase活性,升高糖原含量。
胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中,胰安肽體外并不能直接促進(jìn)P
7、PAR-γ的表達(dá);胰安肽可明顯增加細(xì)胞IRs,p-IRs,p-IRS1和p-Akt的蛋白表達(dá)。胰安肽協(xié)同胰島
素可顯著促進(jìn)細(xì)胞膜上GLUT4的含量;胰安肽可增加總的GLUT4含量,但并不十分明顯。使用 siRNA技術(shù)沉默 IRs基因后,可以逆轉(zhuǎn)胰安肽誘導(dǎo)對(duì)葡萄糖的消耗,但在胰島素的協(xié)同作用下,胰安肽可發(fā)揮促葡萄糖作用。沉默IRs可以逆轉(zhuǎn)胰安肽對(duì)IRs表達(dá)的誘導(dǎo)作用和胰島素受體信號(hào)通路的激活。
2.胰安肽體外對(duì)高糖所致
8、NIT-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究
胰安肽對(duì)NIT-1細(xì)胞具有保護(hù)作用,但不顯著促進(jìn)細(xì)胞胰島素的分泌。
3.胰安肽體內(nèi)降糖作用研究
給藥期間,胰安肽能顯著降低2型糖尿病小鼠血糖,但對(duì)小鼠體重?zé)o明顯改善作用;口服胰安肽可改善小鼠糖耐量異常;胰安肽降低血糖-時(shí)間曲線下面積;胰安肽降低血清總膽固醇和甘油三酯水平,但對(duì)血清胰島素?zé)o顯著影響;胰安肽升高脂肪和肌肉組織中己糖激酶和蘋果酸脫氫酶活性,升高肝臟 GK和降低G-
9、6-Pase的活性。
RT-PCR檢測肌肉脂肪肝臟組織中胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示:胰安肽具有逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗所致的IRs, IRS1的基因表達(dá)的降低。WB結(jié)果顯示,胰安肽增加肌肉組織IRs和IRS1總蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)胰安肽能夠顯著改善蛋白磷酸化水平。胰安肽對(duì)GLUT4總蛋白水平無影響,但是能促進(jìn)GLUT4到達(dá)細(xì)胞膜,增加GLUT4在膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的功能。
4.胰安肽口服吸收特點(diǎn)研究
口服給予胰
10、安肽60min后,可在血漿中檢測到完整的胰安肽成分。
研究結(jié)論:1.體外胰安肽具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取作用,該作用伴隨著GK活性升高, G-6-Pase活性的降低,以及糖原含量的增加。該作用與胰安肽改善胰島素受體信號(hào)通路有關(guān)。
2.胰安肽可保護(hù)NIT-1細(xì)胞,但是對(duì)胰島素分泌無顯著促進(jìn)作用。
3.口服胰安肽具有改善2型糖尿病小鼠糖脂代謝的作用,該作用一方面與其促進(jìn)胰島素受體的表達(dá)有關(guān);另一面與其促進(jìn)
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