抗T2DM新生物活性肽藥理作用及機制研究.pdf

1、實驗背景:胰安肽(aglycin)是從大豆種子中提取得到的含有37個氨基酸殘基的新生物肽，在鏈內具有六個半胱氨酸，依次為鏈內第3、7、15、20、22和32位氨基酸，該結構不僅表現(xiàn)為穩(wěn)定的物理化學性質，而且還有廣泛的生理活性。對胰安肽前期研究結果顯示：胰安肽體外具有耐胃蛋白酶,胰蛋白酶和蛋白內切酶Glu-C(金黃色葡萄球菌V8蛋白酶)降解作用，同時體外具有保護胰腺β細胞的作用。本課題組對其體內藥理活性進行了一系列的篩選，結果顯示：胰安肽

2、對1型糖尿病小鼠血糖并無明顯的改善作用，而口服胰安肽卻對2型糖尿病小鼠具有降低血糖的作用。
　　研究目的:鑒于前期對胰安肽的藥理學篩選結果顯示胰安肽具有口服降低2型糖尿病小鼠血糖作用，以及改善胰島素抵抗和β細胞保護在2型糖尿病治療中的積極作用，本課題組將對口服胰安肽對2型糖尿病的作用及機制進行研究。
　　研究方法:1.胰安肽體外對胰島素抵抗作用研究
　　建立HepG2細胞株高胰島素誘導的胰島素抵抗模型，MTT法檢測胰安

3、肽對正常和胰島素抵抗 HepG2細胞增殖的影響；檢測胰安肽對正常和胰島素抵抗HepG2細胞在胰島素協(xié)同或不協(xié)同作用對葡萄糖消耗的影響，以及葡萄糖代謝中的重要酶葡萄糖激酶（GK），葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的活性變化，以及肝糖原含量的變化。研究胰安肽對胰島素敏感性相關的重要蛋白的影響；并通過
　　siRNA沉默IR，檢測胰安肽對葡萄糖消耗以及胰島素受體信號通路的影響。
　　2.胰安肽體外對高糖所致NIT-1細胞損傷

4、的保護作用研究
　　采用高糖環(huán)境誘導NIT-1細胞損傷，通過檢測細胞活力和胰島素分泌水平，研究胰安肽對NIT-1細胞的保護和促胰島素分泌作用。
　　3.胰安肽體內降糖作用研究
　　采用高脂飼料喂養(yǎng)和腹腔注射STZ誘導2型糖尿病小鼠模型，通過檢測血糖，總膽固醇，甘油三酯的水平，研究胰安肽降低血糖血脂的作用；通過檢測血清胰島素，口服糖耐量，胰島素耐受測試，研究胰安肽對葡萄糖的利用和改善胰島素敏感性的作用；通過檢測肌肉組織和

5、脂肪組織中果糖激酶（HK）,蘋果酸脫氫酶（MDH），肝臟組織GK和G-6-Pase的活性的變化，研究胰安肽對外周組織重要葡萄糖代謝酶的影響；通過real-time PCR檢測肌肉、肝臟、脂肪組織胰島素受體信號通路中關鍵基因表達的變化和 WB檢測肌肉組織蛋白及其磷酸化水平的變化，明確胰安肽對胰島素信號通路的影響。
　　4.胰安肽口服吸收特點研究
　　采用HPLC檢測口服胰安肽后小鼠體內胰安肽的濃度。
　　研究結果:1.胰

6、安肽體外對胰島素抵抗作用研究
　　胰安肽對正常和胰島素抵抗 HepG2細胞具有促進增殖作用，在胰島素抵抗HepG2細胞內，在加入或不加入胰島素刺激胰島素信號通路時，胰安肽各劑量組對葡萄糖的攝取明顯高于模型對照組，且呈劑量依賴性。采用胰島素作用15 min后，激活胰島素信號通路，在胰島素的協(xié)同作用下，胰安肽能顯著性增加GK活性，降低G-6-Pase活性，升高糖原含量。
　　胰島素抵抗HepG2細胞中，胰安肽體外并不能直接促進P

7、PAR-γ的表達；胰安肽可明顯增加細胞IRs，p-IRs，p-IRS1和p-Akt的蛋白表達。胰安肽協(xié)同胰島
　　素可顯著促進細胞膜上GLUT4的含量；胰安肽可增加總的GLUT4含量，但并不十分明顯。使用 siRNA技術沉默 IRs基因后，可以逆轉胰安肽誘導對葡萄糖的消耗，但在胰島素的協(xié)同作用下，胰安肽可發(fā)揮促葡萄糖作用。沉默IRs可以逆轉胰安肽對IRs表達的誘導作用和胰島素受體信號通路的激活。
　　2.胰安肽體外對高糖所致

8、NIT-1細胞損傷的保護作用研究
　　胰安肽對NIT-1細胞具有保護作用，但不顯著促進細胞胰島素的分泌。
　　3.胰安肽體內降糖作用研究
　　給藥期間，胰安肽能顯著降低2型糖尿病小鼠血糖，但對小鼠體重無明顯改善作用；口服胰安肽可改善小鼠糖耐量異常；胰安肽降低血糖-時間曲線下面積；胰安肽降低血清總膽固醇和甘油三酯水平，但對血清胰島素無顯著影響；胰安肽升高脂肪和肌肉組織中己糖激酶和蘋果酸脫氫酶活性，升高肝臟 GK和降低G-

9、6-Pase的活性。
　　RT-PCR檢測肌肉脂肪肝臟組織中胰島素信號通路相關基因表達結果顯示：胰安肽具有逆轉胰島素抵抗所致的IRs, IRS1的基因表達的降低。WB結果顯示，胰安肽增加肌肉組織IRs和IRS1總蛋白的表達水平，同時胰安肽能夠顯著改善蛋白磷酸化水平。胰安肽對GLUT4總蛋白水平無影響，但是能促進GLUT4到達細胞膜，增加GLUT4在膜上的轉運葡萄糖的功能。
　　4.胰安肽口服吸收特點研究
　　口服給予胰

10、安肽60min后，可在血漿中檢測到完整的胰安肽成分。
　　研究結論:1.體外胰安肽具有促進HepG2細胞葡萄糖攝取作用，該作用伴隨著GK活性升高， G-6-Pase活性的降低，以及糖原含量的增加。該作用與胰安肽改善胰島素受體信號通路有關。
　　2.胰安肽可保護NIT-1細胞，但是對胰島素分泌無顯著促進作用。
　　3.口服胰安肽具有改善2型糖尿病小鼠糖脂代謝的作用，該作用一方面與其促進胰島素受體的表達有關；另一面與其促進