麻疹病毒載體的優(yōu)化與改造.pdf

1、本文在如何提高拯救效率，提高下游基因的轉錄水平，方便外源基因引入等方面進行了探索，并對重組有外源基因的麻疹病毒全基因組感染性克隆進行拯救。構建了適合麻疹病毒感染的Vero細胞T7 RNA聚合酶穩(wěn)定表達細胞系，用以啟動麻疹病毒全基因組的轉錄并與常用的痘苗病毒表達系統(tǒng)進行比較分析。 置于T7啟動子控制下的全基因組質粒的轉錄水平受到很多因素影響，鳥嘌呤是其中的一個重要影響因素。構建了麻疹病毒微復制子并以其為模型來研究如何提高病毒的拯救

2、效率。首先對鳥嘌呤和錘頭狀核酶對轉錄水平的影響進行比較分析，在麻疹病毒微復制子質粒的基礎上，構建了含有3個鳥嘌呤(G)和錘頭狀核酶(HamRz)的PminiEGFP3G、2個G和HamRz的PminiEGFP2G、不含G只含HamRz的PminiEGFPOG和含有3個G但不含HamRz的PminiEGFP3G一共4個質粒。拯救后通過熒光分析和FACS分析對4個質粒的拯救效率進行比較，結果表明，PminiEGFP3G的拯救效率最高，而Pm

3、iniEGFPOG的拯救效率比較低，PminiEGFP3G-質粒由于與副粘病毒科6的倍數(shù)原則相違背，拯救效率最差?？梢姡B嘌呤對微復制子質粒的拯救效率有影響，3個鳥嘌呤與錘頭狀核酶的結合是提高微復制子質粒拯救效率的最佳組合。針對鳥嘌呤對麻疹病毒拯救效率的影響進行了研究，為以T7啟動子為基礎的單股負鏈RNA病毒的拯救進行了有益的探索。 MV病毒全基因組的轉錄是在T7啟動子的控制下，產(chǎn)生的負鏈基因組與病毒結構蛋白N、P、L形成RNP后，充當

4、RNA合成的模板。但是在真核細胞中不具有T7RNA聚合酶，轉錄過程的實現(xiàn)必須通過外源來提供聚合酶。構建了一株穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶的細胞系(Vero/pcDNA3-T7)，用于麻疹病毒的拯救過程。經(jīng)免疫印跡實驗表明在無選擇壓力情況下，連續(xù)傳40代(約120天)T7 RNA聚合酶基因在vero細胞中可以穩(wěn)定表達。將T7啟動子控制下含有報告基因(EGFP)的表達質粒pT7IP-EGFP轉染細胞后，綠色熒光蛋白能夠表達，表明表達出的蛋白具有

5、聚合酶的活性，能夠驅動T7啟動子下游基因的表達。將反向插入報告基因的微復制子質粒PminiEGFP轉染已經(jīng)感染過麻疹病毒CC-47株的細胞Vero/pcDNA3-T7，細胞株中能夠檢測到報告基因的表達，與痘苗病毒-T7載體系統(tǒng)相比報告基因的拯救量增加，并且細胞無明顯死亡，顯示了拯救方法的優(yōu)越性。 麻疹病毒基因的轉錄起始于病毒基因組的3’端，聚合酶沿著基因起始(GS)和基因結束(GE)信號序列順序依次進行轉錄，每經(jīng)過一個基因轉錄水

6、平就會明顯下降。對本實驗室前期構建的麻疹病毒全基因克隆進行進一步優(yōu)化和修飾。首先將麻疹病毒N-P基因間結構類似的GS和GE信號序列，插入到麻疹病毒基因組結構基因P和M之間非必須區(qū)域，命名為NPaigr結構，并在GS和GE之間引入多克隆位點以利于外源基因的引入。為驗證合成的NPaigr結構是否具有驅動外源基因表達的功能，在麻疹病毒微復制子質粒的基礎上構建雙順反子質粒pMVaigrEGFP/HTNS，其結構為：啟動子-HamRz-MV 5’

7、Trailor-反向EGFP-NPaigr-反向漢灘病毒核蛋白基因(HTNS)-MV 3’Leader-HdvRz。結果表明，在MV預先感染的Vero/pcDNA3-T7細胞中，報告基因綠色熒光蛋白能夠表達，說明NPaigr結構能夠驅動其下游的基因表達。然后將NPaigr結構克隆到MV全基因組克隆中，將漢灘病毒84FLi的核蛋白的編碼區(qū)和報告基因EGFP分別插入到麻疹病毒全基因組表達載體的多克隆位點，構建成兩個重組麻疹病毒載體表達質粒p

8、Rz8F7Raigr-HTNS和pRz8F7Raigr-EGFP，同時保證了插入后麻疹病毒全基因組堿基數(shù)是6的倍數(shù)。將上述2個質粒分別與輔助質粒麻疹病毒結構蛋白表達質粒pcDNA3-N、pcDNA3-P及pGEM3zf-L共轉染T7RNA聚合酶穩(wěn)定表達Vero細胞系Vero/pcDNA3-T7，經(jīng)過細胞傳代進行麻疹病毒重組全基因組感染性克隆的拯救試驗。在第二代細胞中經(jīng)過ELISA、免疫熒光、RT-PCR以及序列測定突變標簽等方法鑒定有麻