NSAIDS藥萘普生鈉可通過(guò)ERK途經(jīng)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡.pdf

1、ERK信號(hào)途徑的激活與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，ERK是一種與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的重要信號(hào)蛋白，也是控制乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵點(diǎn)。ERK通過(guò)磷酸化抗凋亡分子，同時(shí)激活轉(zhuǎn)錄因子以刺激表達(dá)存活相關(guān)基因而產(chǎn)生抗凋亡作用，同時(shí)ERK通過(guò)磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。NSAIDs是一類廣泛應(yīng)用于臨床的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，其作用機(jī)

2、制是抑制環(huán)氧合酶，阻斷花生四烯酸（arachidonic acid，AA）前列腺素（prostaglandins，PGs）的生物合成，從而發(fā)揮其抗炎作用。本研究通過(guò)觀察不同濃度的萘普生鈉對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡情況，明確該藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的促凋亡作用，同時(shí)通過(guò)Western blot方法檢測(cè)ERK及P-ERK的表達(dá)，明確藥物促凋亡作用的途徑和方式。
　　 材料和方法：
　　 一、材料
　　 細(xì)胞株MDA-MB

3、-231和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室凍存。
　　 二、主要試劑
　　 濃縮型兔抗人ERK1/2單抗（L352）購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司，濃縮型兔抗人P-ERK1/2單抗（Y204）購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司。濃縮型辣根酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（BS10350）購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司。
　　 流式細(xì)胞儀試劑盒購(gòu)于欣博盛公司。
　　 萘普生鈉購(gòu)于山西普德藥業(yè)有限公司。
　　

4、 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）細(xì)胞培養(yǎng)和分組
　　 分別培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231，兩種乳腺癌細(xì)胞各分為四組，分別為對(duì)照組、低濃度藥物處理組、中等濃度藥物處理組和高濃度藥物處理組。對(duì)照組、低濃度藥物處理組、中等濃度藥物處理組和高濃度藥物處理組分別對(duì)應(yīng)藥物濃度為0mmol/L、1mmol/L、5mmol/L，和10mmol/L。
　　 （二）流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡
　　 采用Annexin

5、V/PI雙染色法，流式細(xì)胞儀（BD FACScalibur）分析，結(jié)果采用Cellquest軟件分析處理。
　　 （三）Western blot
　　 常規(guī)收集不同濃度萘普生鈉作用24 h后的MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌細(xì)胞，冷凍離心取上清液分裝，Bradford法測(cè)定細(xì)胞提取物的蛋白濃度。以特異性識(shí)別雙磷酸化ERK1/2的抗體檢測(cè)磷酸化ERK1/2的量；以抗總ERK1/2抗體檢測(cè)總ERK1/2的量為內(nèi)對(duì)照。用

6、SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將PVDF膜放入封閉緩沖液，室溫封閉1 h，加入兔抗人ERK-1/2抗體及兔抗人P-ERK抗體，過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，將Western印跡試劑均勻涂于PVDF膜上，傾去發(fā)光試劑，用保鮮膜蓋于PVDF膜上一暗室內(nèi)將x線片置于保鮮膜上，沖洗x線片，拍照及進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，應(yīng)用BandScar5.0軟件進(jìn)行結(jié)果灰度值檢測(cè)。
　　 （四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)

7、行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)方法分析各組Western blot圖像灰度值和流式細(xì)胞儀凋亡率，P<0.05為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、流式細(xì)胞儀結(jié)果
　　 MCF-7和MDA-MB-231兩組間比較P>0.05，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同濃度藥物處理各組間P<0.05，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時(shí)藥物濃度與細(xì)胞凋亡率具有明顯相關(guān)性。
　　 2、Western blot結(jié)果
　　 不同藥物濃度各組

8、間ERK表達(dá)比較P>0.05，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而P-ERK表達(dá)則P<0.05，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)藥物濃度與P-ERK表達(dá)具有明顯負(fù)相關(guān)。
　　 討論：
　　 ERK1/2是由Boulton等于90年代初期先后分離鑒定的一種蛋白激酶，ERK可通過(guò)磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。ERK信

9、號(hào)途徑的激活與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，ERK是一種與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的重要信號(hào)蛋白，也是控制乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵點(diǎn)。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控，尤其是在細(xì)胞增殖、分化與凋亡中，起著關(guān)鍵作用。本研究證實(shí)乳腺癌細(xì)胞凋亡與P-ERK的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，而與ERK的表達(dá)沒(méi)有明顯相關(guān)性，表明ERK磷酸化途徑是乳腺癌細(xì)胞抗凋亡的關(guān)鍵途徑之一。NSAIDs是一類廣泛應(yīng)用于臨床的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，近年來(lái)，關(guān)于NSAIDs的抗腫瘤的作用，已經(jīng)

10、成為人們的研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)不同藥物濃度處理乳腺癌細(xì)胞觀察，發(fā)現(xiàn)萘普生鈉具有明顯的乳腺癌細(xì)胞的促凋亡作用，并且該作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)雌激素受體陽(yáng)性MCF-7和雌激素受體陰性MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的ERK及P-ERK表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)萘普生鈉對(duì)兩種細(xì)胞ERK的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響，而對(duì)P-ERK的表達(dá)具有顯著的抑制作用，同時(shí)該抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，具有明顯的相關(guān)性，與雌激素受體無(wú)相關(guān)性，從而表明萘普生鈉可通過(guò)抑