血小板膠原受體GPIa-IIa和GPIV功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血栓形成不僅是血栓栓塞性疾病(如冠心病、腦血管血栓病等)發(fā)病機(jī)制中重要的環(huán)節(jié)，而且也是多種其它類型疾病及常見(jiàn)診治過(guò)程中(如糖尿病、腎病綜合癥、外科手術(shù)等)必須面對(duì)的問(wèn)題。血小板是生理性、病理性止血和血栓形成過(guò)程中的核心因素；膠原是血管內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)中與止血和血栓形成密切相關(guān)的蛋白組分。血小板與膠原的相互作用是血栓形成過(guò)程最主要的啟動(dòng)因素，兩者相互作用產(chǎn)生和釋放的多種生物活性物質(zhì)，更是在觸發(fā)和調(diào)控后續(xù)的一系列瀑布樣反應(yīng)中發(fā)揮著重要功能。

2、研究血小板與膠原相互作用的首要內(nèi)容是闡明血小板膠原受體的功能。被認(rèn)作血小板膠原受體的分子都是血小板膜表面的糖蛋白，它們介導(dǎo)了血小板與膠原最初的粘附過(guò)程，引發(fā)了血小板活化，導(dǎo)致血小板聚集反應(yīng)、釋放反應(yīng)的發(fā)生。 在歷史上，曾有多種蛋白分子被提出作為血小板膠原受體的候選者，但大多被后續(xù)研究排除。最近十幾年，較受關(guān)注的候選者是血小板膜糖蛋白Ia／IIa(GPIa／工工a)、血小板膜糖蛋白工V(GPIV)、血小板膜糖蛋白VI(GPVI)等

3、。GPIa／IIa歸屬于整合素家族，被認(rèn)為是介導(dǎo)血小板粘附到膠原的主要受體。GPIV是一種多功能分子，作為血小板膠原受體，介導(dǎo)血小板與膠原相互作用，是否是其主要功能之一尚有爭(zhēng)議。GPVI是免疫球蛋白超家族成員，初步研究顯示它可能在信號(hào)傳導(dǎo)中具有作用。 長(zhǎng)期以來(lái)，在臨床實(shí)驗(yàn)室中用于檢測(cè)血小板功能的手段不能令人滿意。一部分實(shí)驗(yàn)，如玻璃柱粘附實(shí)驗(yàn)等，由于靈敏度精確度差而被淘汰，另一部分實(shí)驗(yàn)，如血栓素B2(TXBz)檢測(cè)、5一羥色胺(S

4、-HT)檢測(cè)等，由于涉及放射污染而鮮有開(kāi)展。在前期工作基礎(chǔ)之上，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板功能得到較好效果。檢測(cè)方法的靈敏度精確度均有顯著提高，且具有高效、快速、無(wú)污染等特點(diǎn)而有利于在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。 本文研究的內(nèi)容是選擇血小板膠原受體GPIa／IIa和GPIV作為切入點(diǎn)，首先探討了GPIa／IIa和GPIV在血小板與膠原相互作用過(guò)程中各自發(fā)揮的功能，主要包括這兩種分子對(duì)血小板三種功能層面(即粘附反應(yīng)、聚集反應(yīng)、釋放反應(yīng))

5、的具體影響；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了將血小板膠原受體GPIV作為血栓形成傾向早期診斷新指標(biāo)的可行性。通過(guò)以上研究過(guò)程，完善了止血和血栓形成機(jī)制的理論、改進(jìn)了血小板功能檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、建立了適合臨床使用的監(jiān)測(cè)血栓形成傾向的新指標(biāo)。 研究方法如下： 1．在檢測(cè)血小板粘附膠原的功能中，我們利用流式細(xì)胞術(shù)在有／無(wú)抗6PIa／工工a抗體或抗GP工V抗體條件下，分別檢測(cè)血小板對(duì)膠原的粘附能力，進(jìn)而觀察了粘附進(jìn)程中不同時(shí)間點(diǎn)造成的粘附

6、能力差異。 2．在檢測(cè)由膠原誘導(dǎo)的血小板聚集功能中，我們利用三個(gè)不同指標(biāo)(最大聚集率、聚集曲線斜率和聚集反應(yīng)延遲時(shí)間)來(lái)反映膠原受體GPIa／I工a和GP工V發(fā)揮的不同作用。 3．在檢測(cè)由膠原引發(fā)的血小板釋放功能時(shí)，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板釋放反應(yīng)標(biāo)志物CD62P來(lái)反映血小板釋放功能在膠原受體受抑制前后的變化。 4．在建立血栓形成檢測(cè)新指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用凝血酶活化血小板后，膠原受體GPIV的上升率在正常個(gè)

7、體和患者之間的差異來(lái)反映活化血小板的存在。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： L阻斷GPIa／IIa造成血小板粘附能力的顯著下降；阻斷GPIV盡管不能顯著減少血小板對(duì)膠原的粘附，但能在血小板粘附膠原的早期延緩粘附進(jìn)程。 2．當(dāng)用強(qiáng)誘導(dǎo)劑膠原誘導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)時(shí)，阻斷GPIa／工工a能輕度降低血小板聚集反應(yīng)的最大聚集率，阻斷GPIV不能有效地降低血小板聚集反應(yīng)的最大聚集率；分別阻斷GPIa／IIa或GPIV都能顯著的延遲聚集反應(yīng)啟動(dòng)

8、的時(shí)間并減緩聚集反應(yīng)發(fā)生的速率。 3．在由膠原引發(fā)的血小板釋放反應(yīng)中，膠原受體GPIa／IIa和GPIV是否受抑并不能影響CD62P的表達(dá)。 4．當(dāng)用凝血酶活化血小板后，正常個(gè)體和有成血栓傾向疾病患者的血小板GPIV均有上升，但上升率的差異十分明顯。 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1．血小板膠原受體GPIa／IIa是介導(dǎo)血小板粘附功能的重要分子，抑制GPIa／IIa能造成血小板粘附能力顯著降低；血

9、小板膠原受體GPIV在血小板粘附過(guò)程早期發(fā)揮輔助加速粘附進(jìn)程的作用。 2．膠原受體GPIa／IIa和GPIV是膠原誘導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)中的調(diào)控因素，抑制GPIa／IIa或GPIV主要造成聚集反應(yīng)啟動(dòng)的延遲以及反應(yīng)進(jìn)程的減緩。 3．膠原受體GPIa／IIa和GPIV在由膠原引發(fā)的血小板釋放顆粒內(nèi)容物反應(yīng)中作用微弱。 4．在有成血栓傾向的疾病中，患者血小板用凝血酶活化后，GPIV的變化率能反映體內(nèi)活化血小板的存在，可以