內(nèi)源性硫化氫在大鼠肝硬化不同時期的濃度變化及機制探討.pdf

1、目的： 本研究復制肝硬化早、中、晚期大鼠模型，通過測定H2S在門靜脈血及下腔靜脈血中的濃度，觀察肝組織中CBS和CSE蛋白、CBSmRNA和CSEmRNA的表達，分析內(nèi)源性H2S體系在肝硬化發(fā)生、發(fā)展過程中表達的變化，以探討H2S在肝硬化中的作用，進一步為闡明肝硬化的發(fā)病機制提供理論和實驗依據(jù)。 材料和方法： 1.四氯化碳復合因素法建立肝硬化大鼠模型：40％四氯化碳棉籽油溶液給大鼠皮下注射，首次注射5ml/kg，

2、后每隔4天注射一次，每次3ml/kg，共注射12次，20％乙醇溶液作為唯一飲用液體，并給予高脂高膽固醇飼料。設立正常對照組大鼠，同期皮下注射生理鹽水，劑量同實驗組，采用標準飼養(yǎng)方法。根據(jù)預實驗中肝硬化形成經(jīng)驗，在肝硬化發(fā)生過程的不同時期收集肝硬化大鼠標本，即實驗組大鼠分3批，每批27只，分別在實驗的第15天、第30天、第52天將大鼠用乙醚麻醉，收集血漿及肝臟標本，病理學確定肝硬化分期。 2.結(jié)果觀察：應用蘇術素-伊紅染色觀察肝組

3、織病理形態(tài)學變化，進行肝硬化分期；測定門靜脈及下腔靜脈血漿H2S的含量；應用免疫組化法觀察肝組織中CBS、CSE的表達，并用計算機圖像分析技術半定量檢測其蛋白表達的強弱，灰階值越低說明表達越強；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術（RT-PCR）檢測CBS、CSE mRNA的表達，同時檢測GAPDH的表達作為內(nèi)參照，用凝膠成像分析系統(tǒng)半定量檢測mRNA的表達水平，結(jié)果以目的條帶與GAPDH光密度的比值表示。實驗結(jié)果計量資料采用SPSS11.0軟件描述實

4、驗數(shù)據(jù)特征，作單因素方差分析、獨立樣本t檢驗，相關性分析，P<0.05示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.肝硬化大鼠模型：根據(jù)病理學技術將大鼠分別確定為肝硬化早期組21只、中期組22只、晚期組20只、正常對照組10只。 2.血漿中H2S的檢測： 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠門靜脈血中H2S濃度分別為369.73±43.39、276.29±24.64、182.82±36.08和131.94±23.67μmol

5、/L；肝硬化早期、中期和晚期大鼠門靜脈血中H2S濃度均顯著低于對照組。 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠下腔靜脈血中H2S濃度分別為335.01±89.26、282.46±38.62、219.46±46.76和159.45±34.43μmol/L；與對照組大鼠比較，肝硬化早期、中期以及晚期大鼠的下腔靜脈血H2S均顯著降低。 各組大鼠門靜脈血與下腔靜脈血相比，正常對照組和肝硬化早期組H2S濃度相比差異無統(tǒng)計學意義，但在肝硬化中

6、期組與肝硬化晚期組，門靜脈血中H2S濃度明顯低于下腔靜脈，二者差異有統(tǒng)計學意義。 3.RT-PCR檢測CBS、CSEmRNA的表達 對照組、肝硬化早期、中期和晚期大鼠肝組織中CBSmRNA表達的R值分別為：0.47±0.09、0.58±0.13、0.71±0.20和0.89±0.09；CSEmRNA表達的R值分別是：0.80±0.08、0.99±0.23、1.16±0.20和1.41±0.29，說明各組肝硬化大鼠的肝組織

7、中CBS、CSEmRNA的表達均明顯強于對照組。將同期肝組織中CBSmRNA和CSEmRNA的R值相比，CBSmRNA的表達均明顯低于CSEmRNA的表達。 4.免疫組化檢測CBS、CSE蛋白的表達 免疫組化結(jié)果顯示肝硬化大鼠肝組織CBS、CSE的表達陽性部位在胞漿。圖像分析結(jié)果顯示對照組、肝硬化早、中和晚期組的CBS灰階值分別為185.05±6.23、175.65±4.47、162.18±4.61和145.78±4.4

8、0；CSE灰階值分別為172.85±3.50、166.68±3.78、150.94±7.69和134.57±5.28，說明各組肝硬化大鼠肝組織中CBS以及CSE的表達均顯著高于對照組。將同期肝組織中CBS和CSE的表達相比，CBS的表達均顯著低于CSE的表達。 結(jié)論： 1.成功采用四氯化碳復合因素法制備大鼠肝硬化模型。 2.肝硬化早、中、晚期大鼠門靜脈血和下腔靜脈血中H2S的含量均顯著低于正常對照組，且H2S濃度