慢性充血性心衰實(shí)驗大鼠的認(rèn)知功能變化及大腦海馬區(qū)葡萄糖-脂肪-氨基酸代謝及神經(jīng)遞質(zhì)類基因表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、本研究從中醫(yī)學(xué)整體觀“心主血脈、心主神明”的思想出發(fā)，研究慢性心衰心氣虛證時大腦的認(rèn)知功能變化。 本研究工作首先從文獻(xiàn)的角度，對臨床上充血性心衰(CHF)伴隨認(rèn)知功能的變化進(jìn)行了綜述。在此基礎(chǔ)上，利用大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎后出現(xiàn)CHF以及伴隨的血瘀、心氣虛及心陽虛的中醫(yī)證型演化(前期基礎(chǔ))模型，從Morris實(shí)驗對空間學(xué)習(xí)記憶研究的角度，評價了大鼠心梗后CHF不同時期的空間學(xué)習(xí)記憶能力。此外，利用基因表達(dá)芯片，進(jìn)一步研究了該狀態(tài)

2、下大腦海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)的基因變化規(guī)律?；蛐酒瑪?shù)據(jù)的前期分析采用GeneSringTM分析軟件，基因背景信息來源于GenBankNucleotide、PubMed、RatMap、LocusLink、SWISS-PROT和RGDGENEBANK(大鼠基因數(shù)據(jù)庫)等相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫。 本研究的主要結(jié)論： 1.大鼠在結(jié)扎左前降支冠狀動脈后于術(shù)后10天、30天、60天、90天(70天時連續(xù)給藥L-NNA共22天)和終末期(測定心功能

3、后2天內(nèi)死亡)時分別測定其血流動力學(xué)指標(biāo)，結(jié)果表明術(shù)后各個時期大鼠均出現(xiàn)不同程度的CHF表現(xiàn)。心梗術(shù)后10天大鼠的CI值為(162.9±36.0)ml/min/kg(n=8)；心梗術(shù)后30天和60天時，大鼠CI值分別為(180.1±56.8)ml/min/kg(n=10)和(171.1±38.7)ml/min/kg(n=9)；心梗術(shù)后90天時，其CI值為(131.9±17.1)ml/min/kg(n=10)；CHF終末期的大鼠CI值最低

4、，為(110.7±19.2)ml/min/kg(n=3)。 2.Morris水迷宮實(shí)驗表明，正常組大鼠、術(shù)后30天和術(shù)后60天三組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，沒有發(fā)生明顯變化。術(shù)后10天、術(shù)后90天和CHF終末期大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能發(fā)生了明顯變化。各組陽性結(jié)果為：①術(shù)后10天組：術(shù)后10天大鼠Morris學(xué)習(xí)記憶穩(wěn)定期(后8組次訓(xùn)練)平均對數(shù)潛伏期，手術(shù)組為(0.971±0.467)秒(n=128)，假手術(shù)組為(0.819±0

5、.355)秒(n=112)，手術(shù)組明顯比假手術(shù)組長；搜索策略，手術(shù)組的認(rèn)知較好率為(96/128，75.0％)，假手術(shù)組為(100/112，89.3％)，兩組相比X2=8.142，P＜0.005；②終末期組：大鼠全部9組次訓(xùn)練的平均對數(shù)潛伏期，終末期為(1.606±0.479)秒(n=80)，終末對照為(1.165±0.469)秒(n=80)，終末期明顯比對照組長；搜索策略，終末期的認(rèn)知較好率為(13/70，18.6％)，終末對照的認(rèn)知

6、較好率為(32/70，45.7％)，兩組相比X2=11.82，P＜0.005；③90天組(術(shù)后70天后連續(xù)給藥L-NNA共22天，分為L-NNA組和L-NNA對照組)：L-NNA組全部9組次訓(xùn)練的平均對數(shù)潛伏期為(1.248±0.508)秒(n=180)，L-NNA對照組的平均對數(shù)潛伏期為(1.500±0.520)秒(n=162)，L-NNA組比L-NNA對照組的平均對數(shù)潛伏期明顯縮短，差異顯著；搜索策略方面，L-NNA組總的認(rèn)知能力較

7、好率為(99/180，55.0％)，L-NNA對照組的認(rèn)知能力較好率為(50/162，30.9％)，兩組間比較，X2=11.82，P＜0.005。 3.本實(shí)驗共使用13張R40s芯片，其中每張芯片總基因數(shù)為4096條，未知基因789條，EST為2670條，已知功能核苷酸片段為637條。本研究采用重復(fù)基因芯片的方法進(jìn)行芯片假陽性率的控制，即分析的基因為兩張(及以上)芯片同時為陽性的基因(共43條)，將只有一個有效數(shù)據(jù)的陽性基因或只

8、有一個數(shù)據(jù)為陽性的基因(共69條)，從總的陽性基因(共112條)中剔除。其中，一張芯片使用的總RNA取材自1只大鼠，另一張芯片使用的總RNA取材自同組的2只大鼠合并后的總RNA。芯片實(shí)驗共分三組：術(shù)后10天組、術(shù)后60大組和術(shù)后90天組。 4.大鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)的基因芯片陽性數(shù)據(jù)結(jié)果：已知的637條基因中，術(shù)后10天組海馬區(qū)陽性表達(dá)基因有24條，皮質(zhì)區(qū)1條；術(shù)后60天組海馬區(qū)陽性表達(dá)基因有14條；術(shù)后90天組海馬區(qū)陽性表達(dá)基因有4

9、條。在三組中的所有陽性基因，除了術(shù)后60天有2條基因表現(xiàn)為上調(diào)，其余均表現(xiàn)為下調(diào)； 5.基因芯片分析結(jié)果：①心梗CHF形成期(術(shù)后10天組)海馬區(qū)，存在較明顯的葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代謝類基因的陽性表達(dá)：CHF后10天糖/能量代謝類基因變化主要是丙酮酸激酶3(NM053297)基因，這條基因所控制的蛋白質(zhì)是在大腦糖/能量代謝過程中起關(guān)鍵作用的酶，是糖酵解過程中重要的限速酶，該基因的表達(dá)下調(diào)，提示CHF后10天海馬區(qū)的糖/能量代謝

10、出現(xiàn)障礙；脂肪酸代謝類基因的陽性表達(dá)有催化脂肪酸氧化后生成酮體過程的最后一步反應(yīng)酶——3-羥3-甲基輔酶A裂解酶基因(NM_024386)，其表達(dá)在術(shù)后10天出現(xiàn)下調(diào)。脂肪酸β氧化生成的乙酰輔酶A在進(jìn)入酮體生成途徑，再進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為大腦進(jìn)行供能過程中，3-羥3-甲基輔酶A裂解酶的基因控制該反應(yīng)的最后一步，因此該條基因的表達(dá)下調(diào)，提示大腦的脂肪酸β氧化后后成酮體生成過程出現(xiàn)障礙；在氨基酸代謝方面，谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶2基因(NM013

11、177)在術(shù)后10天表達(dá)下調(diào)。該基因在氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用中起重要作用，尤其是影響谷氨酸和天冬氨酸的代謝，而這兩個氨基酸同時還是大腦重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)；②心梗CHF形成期(術(shù)后10天組)海馬區(qū)，存在較明顯的神經(jīng)遞質(zhì)類基因的陽性表達(dá)：心梗CHF形成期(術(shù)后10天組)海馬區(qū)，除了影響谷氨酸和天冬氨酸代謝的谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶2基因(NM013177)表達(dá)下調(diào)外，乙酰膽堿類代謝基因也出現(xiàn)了變化，包括煙堿ε多肽乙酰膽堿受體基因(NM017194

12、)表達(dá)下調(diào)和與乙酰膽堿釋放有關(guān)的ATP敏感鉀通道Endosulfine蛋白基因(NM021842)表達(dá)下調(diào)，說明了CHF時的認(rèn)知功能變化與大腦的神經(jīng)遞質(zhì)變化關(guān)系密切；③心梗后CHF形成期海馬區(qū)神經(jīng)鞘脂代謝、細(xì)胞骨架及神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子運(yùn)輸、脂質(zhì)代謝等的變化，一定程度上也揭示了這些基因與太腦認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。 6.本研究是在王碩仁研究員對CHF大量的前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)行的，因此對于中醫(yī)證型的研究未作重點(diǎn)討論。但本研究從實(shí)驗角度