FLT3靶向RNA干擾的抗白血病效應(yīng)及NF-κB通路、SMRT在FLT3信號(hào)傳導(dǎo)中的作用.pdf

1、急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myelocytic Leukemia，AML)是造血系統(tǒng)的惡性侵襲性疾病，盡管誘導(dǎo)化療能使70％以上的患者獲得臨床緩解，但大部分之后復(fù)發(fā)，AM[，患者長(zhǎng)期存活率只在40％左右，更有效的治療策略急待開(kāi)發(fā)。 FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)KT3)是Ⅲ型受體酪氨酸激酶(RTK)受體家族的成員，在骨髓中主要表達(dá)在CD34<'+>的造血干/祖細(xì)胞及樹(shù)突狀前體細(xì)

2、胞上，配體介導(dǎo)的FLT3活化在造血原始細(xì)胞的增殖、分化中有重要的作用。然而超過(guò)70％的AML細(xì)胞表面表達(dá)有野生型FLT3、25～35％的表達(dá)有突變型FLT3，包括30％左右的FLT3近膜結(jié)構(gòu)域短串聯(lián)重復(fù)突變(FLT3-ITD)和7％的酪氨酸激活結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變(FLT3-TDK)。FLT3異常表達(dá)和患者的臨床白細(xì)胞增多癥、預(yù)后差密切相關(guān)。 FLT3作為AML治療極有前景的分子靶標(biāo)深受關(guān)注。目前已開(kāi)發(fā)了幾種FLT3抑制劑，但Ⅰ、Ⅱ期臨

3、床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不令人滿意。首先沒(méi)有一種抑制劑是真正FLT3特異性的，它們也可識(shí)別VEGF、c-KIT、FMS及PDGF等受體，臨床毒副作用不可避免；另外FLT3-TDK各種點(diǎn)突變引發(fā)FLT3結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，也導(dǎo)致了某些FLT3抑制劑的耐藥問(wèn)題。更重要的是AML的發(fā)病具多基因突變累加的特點(diǎn)，相關(guān)基因的研究遠(yuǎn)未完善；研究證實(shí)FLT3信號(hào)傳導(dǎo)涉及許多中介分子，但大多數(shù)在此信號(hào)級(jí)聯(lián)中的地位和作用還不清楚，進(jìn)一步闡明FLT3與其它分子相互作用的機(jī)制

4、，F(xiàn)LT3異常激活引發(fā)的下游信號(hào)途徑，將為FLT3靶向治療研究提供新的視野。 RNA干擾是FLT3靶向抑制的另一策略，它不僅為FLT3功能學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具，也是AML極有前景的基因治療手段。本研究中首先設(shè)計(jì)、合成了3條FLT3靶向的短發(fā)夾狀干擾RNA(FLT3-shRNA)，通過(guò)轉(zhuǎn)染FLT3過(guò)表達(dá)的AML細(xì)胞株，評(píng)價(jià)其抑制效應(yīng)，篩選出效率高的1條；隨后體外實(shí)驗(yàn)中探討了FLT3表達(dá)的下調(diào)對(duì)THP-1、HL-60細(xì)胞增殖，凋

5、亡的作用。目前對(duì)FLT3信號(hào)傳導(dǎo)的研究，野生型主要集中在P13K-AKT、RAS-MAPK、SRC通路上，ITD突變型還包括STAT5通路，對(duì)在AML發(fā)生、發(fā)展中有重要作用的核因子кB(Nuclear Factor Kappa B，NF-кB)通路、輔抑制子維甲酸/甲狀腺受體沉默因子(Silencing Medtiator for Retinoic Acid and Thyroid Hormone Receptor，SMRT)，研究還少

6、有涉及。 NF-кB是一類核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)cyclinD1，c-myc，Bcl-2等基因的轉(zhuǎn)錄，可正性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程；SMRT是真核生物基因轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)的基本成分，因此作者通過(guò)RNA干擾的方法下調(diào)FLT3表達(dá)，探討NF-кB通路、SMRT在FLT3信號(hào)傳遞中的可能作用。并通過(guò)建立THP-1白血病細(xì)胞Nu/Nu皮下移植瘤模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察FLT3-shRNA干擾單獨(dú)，或與NF-кB抑制劑Parthenolide(

7、PN)、柔紅霉素(Daunorubicin，DNR)聯(lián)合作用時(shí)的抗白血病效應(yīng)。 第一部分五種髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株FLT3表達(dá)及FLT3-ITD方法突變的研究 1．對(duì)5種髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1、HL-60、K562、Dami及Meg-01，以RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞FLT3 mRNA的表達(dá)。 2．FLT3在細(xì)胞中有胞漿蛋白和跨膜蛋白兩種存在形式，F(xiàn)LT3跨膜蛋白是其活性形式。以Western blotting檢測(cè)

8、FLT3總蛋白的表達(dá)，以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)法檢測(cè)FLT3跨膜蛋白的表達(dá)。 3．鑒于FLT3-ITD突變型與其它類型的FLT3受體激活方式、信號(hào)傳導(dǎo)途徑都有不同，提取各細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增其易發(fā)生ITD突變的近膜區(qū)序列，PCR產(chǎn)物連入T-載體并測(cè)序，檢測(cè)是否存在FLT3-ITD突變。 第二部分 FLT3靶向短發(fā)夾狀干擾RNA體外轉(zhuǎn)錄合成、篩選及作用 方法 1．設(shè)計(jì)、體外轉(zhuǎn)錄合成3條FLT3-shR

9、NA、1條陰性對(duì)照shRNA(NC-shRNA)，確定其濃度。 2．用25nM的3種FLT3-shRNA、NC-shRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，24h、48h及72h分別收獲細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)各組FLT3 mRNA的表達(dá)，以GAPDH作內(nèi)參計(jì)算其mRNA的相對(duì)含量，初步確定各shRNA的干擾效率。 3．將對(duì)mRNA抑制效率較高的FLT3-shRNA1，以5nM、10nM、15nM、20nM、25nM濃度轉(zhuǎn)染THP-1

10、細(xì)胞，48h收獲細(xì)胞測(cè)FLT3 mRNA，評(píng)價(jià)濃度效應(yīng)關(guān)系。 4．將對(duì)mRNA抑制效率達(dá)50％以上的FLT3-shRNA1、shRNA3轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，48h、72h收獲細(xì)胞，以FCM測(cè)FLT3跨膜蛋白的表達(dá)，72h以Western blotting測(cè)FLT3總蛋白的表達(dá)。 5．根據(jù)上述結(jié)果，用15nM的FLT3-shRNA1轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，48h以RT-PCR測(cè)FLT3 mRNA表達(dá)，72h以FCM、Weste

11、rn blotting測(cè)FLT3蛋白的表達(dá)。 第三部分 FLT3靶向RNA干擾抑制THP-1、HL-60細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 方法 以下試驗(yàn)均設(shè)PBS對(duì)照組FLT3-shRNAi組，NC-shRNA組及，分別轉(zhuǎn)染以15nM的FLT3-shRNAl、NC-shRNA，或處理以同體積數(shù)的PBS。 1. 96孔板中THP-1、HL-60細(xì)胞以4×10<'4>/ml密度轉(zhuǎn)染FLT3-shRNA1，培養(yǎng)8天

12、，每天取3孔加入CCK-8，測(cè)定細(xì)胞增殖活力并繪制增殖曲線。細(xì)胞再以4×10<'5>/ml密度轉(zhuǎn)染，24h、48h、72h測(cè)定增殖活力并計(jì)算增殖抑制率。 2．如上述處理細(xì)胞，48h各組細(xì)胞經(jīng)PI染色，用FCM法測(cè)定細(xì)胞周期分布。 3．轉(zhuǎn)染48h分別以Annexin V-FITC法、DNA Ladder法檢測(cè)THP-1、HL-60細(xì)胞凋亡狀況，另THP-1細(xì)胞以TUNEL原位酶標(biāo)記法檢測(cè)凋亡。 4．轉(zhuǎn)染48h和72

13、h，用RT-PCR法檢測(cè)eyelin D1、eyelin A的mRNA表達(dá)；提取細(xì)胞總蛋白，用Western blotting檢測(cè)其蛋白表達(dá)。 第四部分 NF-кB通路、核輔抑制子SMRT在FLT3信號(hào)傳遞中的作用 方法： 1．THP-1細(xì)胞株中用RT-PCR檢測(cè)NF-кB家族的P65、阻遏物IкB mRNA的表達(dá)，用免疫組化、Western blotting法檢測(cè)其蛋白的表達(dá)。 2．96孔板中用0μM～

14、20nM范圍內(nèi)的系列濃度的NF-кB抑制劑Parthenolide(PN)，處理4×10<'5>/ml密度的THP-1細(xì)胞，12h、24h用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，計(jì)算細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)。后根據(jù)上述結(jié)果，用6μM的PN作用于4×10<'4>/ml密度的THP-1細(xì)胞，共培養(yǎng)6天，繪制細(xì)胞增殖曲線。 3．試驗(yàn)共分5組，分別處理以PBS、NC-shRNA、FLT3-shRNAi、Phi及FLT3-shRNA

15、i+PN，轉(zhuǎn)染組均轉(zhuǎn)以15nM的shRNA，作用終時(shí)間48h；PN組處理以6gM的PN，作用終時(shí)間24h。各組細(xì)胞收獲后，用RT-PCR檢測(cè)P65、IкB、cyclinD1及SMRTmRNA的表達(dá)：用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞總蛋白、核蛋白的表達(dá)。 4．FLT3-shRNA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h，分別處理以系列濃度的PN，12h、24h用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，計(jì)算IC<,50>。 5．THP-1細(xì)胞分別處

16、理以PBS、FLT3-shRNAi、PN及FLT3-shRNAi+PN，細(xì)胞收獲后以FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布，以Annexin VFITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 第五部分 Nu/Nu裸鼠移植瘤模型建立及FLT3靶向RNA干擾體內(nèi)抗白血病的效應(yīng)方法 1．指數(shù)生長(zhǎng)期的THP．-細(xì)胞，以1×10<'7>/只劑量接種到Nu/Nu裸鼠右腋皮下，建立THP-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。 2．當(dāng)THP-1移植瘤體積長(zhǎng)到100～300mm

17、<'3>，隨機(jī)分6組，5只/組，各組按既定方案腹腔注射給藥，分別處理以PBS(1組)、FLT3-shRNAi(2組)、PN(3組)、shRNAi+PN(4組)、柔紅霉素(DNR，5組)、shRNAi+DNR(6組)，總計(jì)15天。 3．隔日測(cè)瘤體積，裸鼠體重；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。 4．對(duì)取出的瘤組織，用TUNEL檢測(cè)瘤細(xì)胞凋亡，用免疫組化、RT-PCR、WesternbloRing分別檢測(cè)FLT3、P65