利用LAMP技術(shù)從中間宿主中快速檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchis sinensis).pdf

1、華支睪吸蟲(chóng)病（Clonorchiasis）又稱(chēng)肝吸蟲(chóng)病，是由華支睪吸蟲(chóng)（Clonorchis sinensis）感染引起的一種人獸共患病。華支睪吸蟲(chóng)病主要分布在越南北部、韓國(guó)和中國(guó)的大部分地區(qū)。在我國(guó)主要流行于廣東、廣西、黑龍江、吉林和遼寧等省，共有27個(gè)省、市和自治區(qū)有本病流行或病例報(bào)告。初步估計(jì)全球感染人數(shù)為1500萬(wàn)人。 華支睪吸蟲(chóng)主要寄生于人體肝內(nèi)二級(jí)以上分支的膽管內(nèi)，嚴(yán)重感染時(shí)也會(huì)寄生于膽囊、總膽管甚至胰管內(nèi)。成蟲(chóng)的機(jī)

2、械性損傷和分泌排泄物是主要的致病因素。已經(jīng)有確切證據(jù)證明與華支睪吸蟲(chóng)有關(guān)的疾病包括有膽管炎、膽囊炎、膽石癥、肝硬化、肝膽管癌、兒童生長(zhǎng)發(fā)育障礙、消化性潰瘍、胰腺炎和糖尿病等。2009年3月在法國(guó)里昂召開(kāi)的世界衛(wèi)生組織會(huì)議首次確定華支睪吸蟲(chóng)致肝膽管癌證據(jù)充分。 目前用于華支睪吸蟲(chóng)中間宿主感染診斷的主要方法是病原生物學(xué)檢查，即直接解剖或者借助一定工具和技術(shù)觀察中間宿主中是否存在華支睪吸蟲(chóng)來(lái)加以確定。但是病原生物學(xué)檢測(cè)方法不僅需要有豐

3、富寄生蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)知識(shí)的專(zhuān)業(yè)人員操作，而且需要特定的儀器和設(shè)備，并且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、繁瑣、檢出率不高，因此不適宜用于大規(guī)模的流行病普查。 環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（Loop—mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年新發(fā)展的一個(gè)快速高效、高特異性的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)采用與PCR不同的DNA聚合酶，結(jié)合特殊設(shè)計(jì)的3組引物，能在短時(shí)間內(nèi)得到檢測(cè)對(duì)象的反應(yīng)結(jié)果，并能將反應(yīng)結(jié)果以不同形式（電

4、泳、沉淀、顏色變化）表現(xiàn)出來(lái)。LAMP技術(shù)以其特有的經(jīng)濟(jì)、靈敏、快速、便捷、特異性高等優(yōu)點(diǎn)在出現(xiàn)后迅速被廣泛研究用于病毒、細(xì)菌及寄生蟲(chóng)的檢測(cè)領(lǐng)域。本研究目的在于發(fā)展一種可以從中間宿主中快速檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)的LAMP技術(shù)，從而填補(bǔ)在現(xiàn)場(chǎng)普查和快速診斷領(lǐng)域分子診斷技術(shù)的空白。 本研究基于華支睪吸蟲(chóng)ITS2序列設(shè)計(jì)了包括環(huán)引物在內(nèi)的6條特異性引物組，建立了利用LAMP技術(shù)檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)的反應(yīng)體系。結(jié)果顯示：在Bst DNA聚合酶作用下，

5、反應(yīng)溫度60度（恒溫），反應(yīng)時(shí)間60分鐘為華支睪吸蟲(chóng)基因組DNA的最佳LAMP擴(kuò)增條件。 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)LAMP對(duì)華支睪吸蟲(chóng)基因組DNA的靈敏度，可達(dá)10 fg/μl，比傳統(tǒng)PCR的靈敏度高3個(gè)數(shù)量級(jí)。在相同條件下，通過(guò)對(duì)華支睪吸蟲(chóng)及其他寄生蟲(chóng)（大片吸蟲(chóng)（Fasciola gigantica）、肝片吸蟲(chóng)（Fasciola hepatica）和日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum））以及中間宿主草魚(yú)（Ct

6、enopharyngodon idellus）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，顯示了本研究設(shè)計(jì)的引物組具有高度的特異性。 運(yùn)用LAMP和傳統(tǒng)PCR同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性和陰性樣本，結(jié)果顯示LAMP檢測(cè)結(jié)果與PCR基本一致，且能檢測(cè)出PCR不能檢測(cè)到的陽(yáng)性螺樣本。運(yùn)用LAMP和傳統(tǒng)PCR同時(shí)檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)病流行區(qū)采集的107份螺，魚(yú)以及蝦類(lèi)樣本，結(jié)果表明傳統(tǒng)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為16.8％（18/107），LAMP檢測(cè)的陽(yáng)性率為27.1％（29/107）。