mTOR抑制劑Rapamycin抗Hela細胞雙向電泳差異性分析.pdf

1、背景：雷帕霉素(Rapamycin；Sirolimus；西羅莫司)最初從一種土壤細菌中分離得到，是mTOR的特異性抑制劑，有較強的抑制免疫和抗真菌作用。由于雷帕霉素的這種作用只針對部分腫瘤細胞，且必須依賴其他藥物才能使腫瘤逆轉，因而對mTOR復合物信號通路在體內發(fā)揮功能的具體機制及mTOR的底物存在諸多爭議。 本實驗首先采用MTT比色法，觀察雷帕霉素對人宮頸癌Hela細胞增殖的抑制作用，并計算出48h時的半數(shù)抑制濃度IC50。進

2、一步運用雙向電泳的方法，比較雷帕霉素作用前后細胞蛋白表達的變化，從而篩選出與mTOR活性變化相關的特異性蛋白質。從而為進一步研究mTOR抑制劑雷帕霉素抑制腫瘤細胞生長的作用機制開辟一條新的途徑。 實驗方法：1.細胞培養(yǎng)及雷帕霉素半抑制濃度IC50的測定以含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細胞，按MTT法，酶標儀490nm處測得各組吸光度，計算雷帕霉素對Hela細胞的抑制率。以抑制率為縱坐標，藥物濃度為橫坐標，繪制

3、48小時生長抑制曲線，運用改良的寇氏法計算出IC50。 2.以固相pH梯度等電聚焦(IEF)為第一向的雙向電泳分別以相同條件培養(yǎng)雷帕霉素處理過與未處理的Hela細胞，提取處理組與-1-未處理組的總蛋白并測定濃度。兩步電泳后，運用Umax掃描儀及Labscan軟件獲得凝膠圖像。使用ImageMasterTM2DplatinumSoftware5.0對圖像進行校正、點檢測分析、背景消減、校正和量化。 3.統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)的

4、分析在SPSS13.0軟件和EXCEL上進行，采用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，顯著性水準α=0.05。 結果：1.雷帕霉素對Hela細胞的生長抑制作用隨著濃度和時間的變化而變化。濃度的增加和時間的延長都能夠使雷帕霉素對Hela細胞的抑制率增加。通過運用改良的寇氏法計算出48小時雷帕霉素對Hela細胞的半抑制濃度IC50為38.924nM。小劑量的雷帕霉素能夠有效抑制Hela細胞的增殖。 2.通過對電泳和上樣條件的優(yōu)化，獲

5、得了圖像清晰，分辨率高和重復性好的雙向電泳凝膠圖譜。在相同的條件下，對處理組與未處理組細胞分別進行了三次重復實驗。運用圖像分析軟件分析后發(fā)現(xiàn)，處理組獲得的可分辨蛋白膠點數(shù)為1256±37，未處理組為1312±25。對處理組與未處理組的三塊膠進行匹配，其匹配率分別為89.5％和92.3％。膠點位置的重復性按Corbett等報道的方法進行，任意選擇各組三塊膠中相互匹配和分辨清晰的50個蛋白膠點，選取位置居中的一個蛋白為原點，測出其他兩塊膠對

6、應點在第一向IEF和第二向SDS-PAGE上的偏差，發(fā)現(xiàn)三塊膠在位置上有較好的重復性。其中處理組第一向IEF偏差為1.07±0.12mm，第二向SDS-PAGE偏差為1.22±0.35mm，未處理組第一向偏差為0.89±0.23mm，第二向偏差為1.02±0.26mm。 3.在相同條件下，分別對處理組與未處理組進行三次重復實驗，處理組與未處理組的蛋白分布大致相同。多集中于PI4.0～8.2，MW20.2kD～70.0kD之間。處