人脂肪干細胞與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌機制影響的體外實驗研究.pdf

1、目的:世界范圍內(nèi)，女性乳腺癌發(fā)病率逐年增高。根據(jù)國際癌癥研究中心報告，2008年調(diào)查結(jié)果顯示新發(fā)乳腺癌在女性腫瘤發(fā)病的22.9％，死亡占女性腫瘤的13.7％[1]。在中國，乳腺癌的發(fā)病趨勢傾向年輕女性，新發(fā)生率和死亡率明顯增高。隨著乳腺癌診療水平的提高，早期診斷陽性率更加準(zhǔn)確，乳腺癌的治療方案也有所改變，保乳手術(shù)現(xiàn)今已成為歐美國家治療和研究乳腺癌的熱點[2]。但仍有部分患者需要全乳切除術(shù)等治療，術(shù)后乳腺缺如或者畸形造成患者嚴重的心理障礙

2、，顯著降低生活質(zhì)量[3]。乳腺癌術(shù)后對乳房整形的需求越來越多，從早期即時皮瓣乳房再造到假體置入，都有各自的缺點而讓患者不能接受。材料填充技術(shù)近年在整形外科發(fā)展迅速，自體脂肪曾一度作為理想的填充材料，讓整形外科醫(yī)師看到希望，由于移植后脂肪其成活率低，遠期效果差而幾近淘汰。1995年Coleman成功完成自體顆粒脂肪移植豐乳術(shù)，讓整形自體組織填充看到希望[4]。2006年自體顆粒脂肪細胞輔助移植技術(shù)(Cell assisted lipotr

3、ansfer,CAL)的應(yīng)用，在整形外科領(lǐng)域，豐乳、面部凹陷整形和豐臀等方面的遠期效果理想。移植脂肪組織的萎縮、囊腫、鈣化和壞死率都有明顯減少。CAL通過增加人脂肪來源干細胞(Human adipocyte-derived stem cells，hADSCs)含量，促進脂肪顆粒移植存活和脂肪細胞增殖生長，其成活率增長為30～70％[5]。hADSCs成脂分化中的調(diào)節(jié)機制研究是脂肪顆粒移植的重點，是組織塑形的關(guān)鍵。只有hADSCs向成熟正

4、常細胞分化，才能保證移植的生物安全性。
　　 CAL在先天性乳房發(fā)育不全、外傷性乳腺畸形等方面取得良好的效果，可多次行CAL改善乳房外形，達到塑形效果。但對于女性乳腺癌患者治療術(shù)后乳房整形，國內(nèi)外還有爭議。現(xiàn)今女性乳腺癌發(fā)病率有所上升，由于醫(yī)療條件的改善，早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌的幾率增加，乳腺外科逐漸乳腺癌保乳術(shù)作為乳腺癌手術(shù)治療的首選術(shù)式[6，7]?；颊咝g(shù)后治療方案個體化，使生存率得到延長，生活質(zhì)量有所提高。但術(shù)后女性患者由于乳房縮小

5、、不對稱等因素影響到生活心理，對微創(chuàng)乳腺整形提出要求。傳統(tǒng)二期假體置入隆乳術(shù)缺點為原有手術(shù)瘢痕明顯增寬，術(shù)區(qū)因瘢痕粘連置放假體困難，術(shù)后局部反應(yīng)重，乳房因瘢痕牽拉外形不滿意等。此外乳房假體有可能破裂造成患者心理負擔(dān)過重，影響生活，迫切需要微創(chuàng)有效的乳房整形。乳腺顆粒脂肪細胞輔助移植術(shù)，能解決以上不良情況，對局部隆乳可按需填充，具有最大限度的調(diào)節(jié)乳房外形、創(chuàng)傷小，減輕患者二次手術(shù)痛苦等優(yōu)點。但對其安全性有很大爭議。美國整形外科協(xié)會和法國整

6、形外科協(xié)會對細胞輔助顆粒脂肪移植的生物安全性提出質(zhì)疑，通過臨床病例對照研究，仍未發(fā)現(xiàn)確切的證據(jù)說明其對乳腺癌復(fù)發(fā)、局部浸潤以及遠處轉(zhuǎn)移有影響[8-10]?，F(xiàn)今還需大量臨床病例研究進行遠期隨訪。體外實驗及動物實驗也沒有明確說明細胞輔助的脂肪顆粒移植對乳腺癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)、進展和遠處轉(zhuǎn)移，仍具有很多爭議[11]。
　　 乳腺癌細胞對hADSCs的影響是多方面的。其主要通過細胞之間旁分泌相應(yīng)的細胞因子，互相刺激彼此生長、增殖、遷移。同時

7、對hADSCs多向分化功能產(chǎn)生一定的影響。在CAL中，移植物主要植入皮下、乳腺脂肪及胸大肌等處。hADSCs根據(jù)植入物所處的微環(huán)境，主要促進脂肪組織生長和hADSCs成脂分化為主。在乳腺癌術(shù)后切除局部區(qū)域進行CAL，對hADSCs成脂分化產(chǎn)生的影響還不得而知。
　　 CAL因其增加hADSCs含量，對乳腺癌細胞的影響也是二期行CAL乳房整形手術(shù)應(yīng)關(guān)注的焦點之一[11]。移植的hADSCs是否在乳腺癌術(shù)后的微環(huán)境能成活和正常分化及

8、其轉(zhuǎn)歸？對乳腺癌細胞侵襲力產(chǎn)生作用？主要作用機理是什么？[12]因為考慮細胞之間的主要作用通過旁分泌機制調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化和代謝，所以我們選用乳腺癌無轉(zhuǎn)移的細胞株腺癌MCF-7和浸潤性導(dǎo)管癌BT474作為研究對象，通過體外培養(yǎng)hADSCs、MCF-7、BT474細胞，生長旺盛時期，收集細胞無血清培養(yǎng)液，以及成脂條件培養(yǎng)液，分析細胞間的相互作用。從而為CAL的生物安全性提供理論依據(jù)。
　　 hADSCs成脂過程中，細胞轉(zhuǎn)錄

9、因子影響起主導(dǎo)作用?，F(xiàn)今研究得出。轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulated element binding protein，SREBP1)、脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding proteins，aP2）和(CCAAT/enhancer binding prot

10、eins，C/EBP)等均促進hADSCs脂肪分化，各轉(zhuǎn)錄因子之間互相調(diào)節(jié)，促進細胞內(nèi)脂肪形成，尤其以PPARγ和SREBP1作用明顯[13]。各轉(zhuǎn)錄因子在不同細胞還存在其他功能，其中aP2在腫瘤細胞增殖有雙向調(diào)節(jié)作用，影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[14]。而PPARγ、SREBP1能促進細胞成熟，抑制細胞異常增生[15]。各種因子間存在互相調(diào)節(jié)，依據(jù)其細胞特性和微環(huán)境而變化，因hADSCs在成脂過程中旁分泌作用，是否對乳腺癌細胞的侵襲力有

11、影響？主要途徑是什么？都有待研究。
　　 乳腺癌細胞和hADSCs、成脂細胞(Adipocyte，AC)生長過程中，分泌大量的細胞因子和蛋白酶類，其影響細胞的生長，增殖，分化、復(fù)發(fā)和侵襲。其中與乳腺癌細胞的遷移、浸潤作用明確有關(guān)的細胞因子有尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(Urokinase type plasminogen activator，uPA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2，MMP2)

12、、基質(zhì)金屬蛋白酶9（基質(zhì)金屬蛋白酶9，MMP9）和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)[16,17]。金屬蛋白酶家族主要溶解間質(zhì)膠原，為腫瘤細胞侵潤提供一定的空間基礎(chǔ)，從而促進腫瘤細胞增殖和侵襲力。這些因子在正常細胞中也通過旁分泌作用產(chǎn)生新生血管，組織體積擴充以及促進組織生長等。同樣也是腫瘤細胞生長、浸潤的基礎(chǔ)。通過對細胞相關(guān)因子的研究，可以分析細胞間旁分泌作用機制，為乳腺癌

13、術(shù)后的脂肪顆粒移植隆乳成活機理，乳腺癌復(fù)發(fā)、浸潤、轉(zhuǎn)移提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1取人皮下脂肪組織，Ⅰ型膠原酶消化原代分離培養(yǎng)脂肪干細胞(hADSCs)，通過成脂、成骨多向誘導(dǎo)分化和流式細胞術(shù)檢測CD29、CD34、CD44、CD45、CD105鑒定hADSCs。原代hADSCs培養(yǎng)到第三、四代，更換成脂培養(yǎng)液培養(yǎng)，動態(tài)觀察成脂情況，于第6d、12d細胞提取mRNA和總蛋白，熒光定量PCR檢測PPAR

14、γmRNA、SREBF1 mRNA變化，Westernblot檢測PPARγ、SREBF1含量變化，分析hADSCs成脂過程中轉(zhuǎn)錄因子的變化。
　　 2 hADSCs和AC細胞在96孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合為孔底面積80％以上時，按1∶2、1∶8、1∶16比例將MCF-7和BT474條件培養(yǎng)液和DMEM、成脂培養(yǎng)基（FBS終濃度為10％）混合進行培養(yǎng)，于24h、48h、72hMTT酶標(biāo)儀檢測，確定混合培養(yǎng)液最適濃度比例。
　

15、　 3待細胞生長至瓶底80％以上時，使用成脂培養(yǎng)基、MCF-7和BT474條件培養(yǎng)基加上成脂培養(yǎng)基（終末FBS為10％）共同培養(yǎng)hADSCs和AC，待大量脂肪細胞形成后，提取提取mRNA和總蛋白，熒光定量PCR檢測對轉(zhuǎn)錄因子SREBF-1、PPARγ; Western blot檢測MCF-7、BT474條件培養(yǎng)基對hACSCs和AC的SREBP-1、PPARγ的影響。
　　 4 hADSCs、AC細胞生長至培養(yǎng)瓶底80％以上時

16、，換用無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后收集，運用Transwell小室實驗技術(shù)，預(yù)制基質(zhì)膠，上室為MCF-7、BT474細胞+10％FBS，下室為hADSCs細胞培養(yǎng)液、AC細胞培養(yǎng)液(終濃度含10％FBS)，培養(yǎng)24h后，擦去上室基底基質(zhì)膠，10％多聚甲醛細胞固定后結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，采集圖像，結(jié)晶紫脫色后，酶標(biāo)儀測定，間接反映浸潤細胞含量。
　　 5 MCF-7、BT474、hADSCs、AC細胞生長至培養(yǎng)瓶底80％以上

17、時，換用無酚紅的無血清培養(yǎng)基，24h后收集培養(yǎng)液，ELISA方法檢測培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、金屬蛋白酶2(MMP2)、金屬蛋白酶9(MMP9)、尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)含量。
　　 6培養(yǎng)MCF-7、BT474、hADSCs、AC-12細胞生長至瓶底80％以上時，提取mRNA和總蛋白，熒光定量PCR檢測對轉(zhuǎn)錄因子aP2、PPARγmRNA; Westernblot檢測aP2、PPARγ。
　　 結(jié)果

18、:
　　 1 hADSCs第三、四代為長纖維狀細胞，成簇條索狀排列，細胞中無脂滴。成骨誘導(dǎo)12d可見成骨細胞形成，但鈣鹽沉積較少，細胞明顯變大變圓。油紅”O(jiān)”染色、茜素紅染色陽性，流式細胞術(shù)檢測第三代人脂肪干細胞CD29、CD44、CD105為陽性，CD34、CD45表達為陰性。成脂誘導(dǎo)6d開始有脂滴形成，12d脂滴明顯增多，部分融合大脂滴，細胞形態(tài)為多邊形。成脂誘導(dǎo)6d、12d細胞PPARγmRNA、SREBF1 mRNA均有

19、表達。SREBF1 mRNA6d、12d表達與相應(yīng)蛋白不一致，主要靠轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)為主。PPARγ在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)。
　　 21∶8的MCF-7、BT474條件培養(yǎng)基促進hADSCs和AC的增殖;MCF-7、BT474條件培養(yǎng)基對hADSCs分化為脂肪細胞的時間無影響。MCF-7、BT474條件培養(yǎng)基對細胞中hADSCs成脂前后PPARγ表達無規(guī)律，可能存在旁分泌抑制調(diào)節(jié)，MCF-7對PPARγ抑制更明顯。SREBF-1仍以轉(zhuǎn)錄后調(diào)

20、節(jié)為主。成脂后期均有明顯增高，MCF-7中表達明顯增高。與正常成脂分化和BT474條件培養(yǎng)液相比，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 3 Transwell小室實驗得出hADSCs在成脂前后可增強MCF-7、BT474的侵襲性，hADSCs作用明顯(P＜0.05)。MCF-7結(jié)晶紫染色hADSCs條件培養(yǎng)液組OD為0.263±0.009; AC條件培養(yǎng)液組OD為0.202±0.004，作用較弱(P＜0.05);BT474

21、hADSCs條件培養(yǎng)液組結(jié)晶紫染色OD為0.263±0.005; AC條件培養(yǎng)液組OD為0.206±0.009，作用弱(P＜0.05);
　　 4 uPA、VEGF、MMP2、MMP9在hADSCs成脂分化后培養(yǎng)基中均有表達（分別為4.80×103±266.67 pg/ml、5.10×103±91.30 pg/ml、187.45±20.61 pg/ml、278.97±56.89 pg/ml、4.77×104±0.03 pg/ml

22、、4.93×104±0.22 pg/ml、1.93×103±190.0pg/ml、0.618×103±156.0 pg/ml）;MCF-7、BT474條件培養(yǎng)基中無MMP2表達，MMP9含量無差別（為1.37×103±186.67 pg/ml、0.384×103±136.0 pg/ml），其MCF-7中uPA和VEGF含量呈平行趨勢，含量明顯高于hADSCs和成脂細胞培養(yǎng)液（1.7×104±566.67 pg/ml、320.945±28

23、.03 pg/ml），BT474中VEGF含量較高(371.955±37.512 pg/ml),uPA(5.10×103±88.73 pg/ml)，與hADSCs和AC培養(yǎng)液中明顯差異。在乳腺癌中血管成形能力強，侵襲力較弱;MMP2在hADSCs成脂前后表達均高（4.77×104±30pg/ml、4.93×104±220pg/ml）。
　　 5熒光定量PCR、Westernblot檢測MCF-7、BT474中低表達PPARγmR

24、NA及無蛋白表達;在hADSCs、AC-12中PPARγ高表達，分別為0.591±0.005、0.903±0.009，有統(tǒng)計學(xué)差異;aP2蛋白在MCF-7、hADSCs、BT474、AC-12均有表達。其中AC-12高表達，為1.203±0.004，BT474中為0.520±0.002，呈低表達。
　　 結(jié)論:
　　 CAL技術(shù)的臨床應(yīng)用已經(jīng)趨于成熟，但適用范圍較狹，美國整形外科協(xié)會提出對乳腺癌術(shù)后的脂肪移植治療需有專家

25、評估，根據(jù)具體評定是否適合脂肪移植治療[18]。本課題就乳腺癌保乳術(shù)后CAL中乳腺癌切除術(shù)后“癌床”微環(huán)境對hADSCs成脂前后的影響，以及hADSCs對乳腺癌細胞侵襲力影響進行探討，為CAL是否適用于乳腺癌保乳術(shù)后的乳房整形提供基礎(chǔ)細胞學(xué)理論依據(jù)。
　　 1 CAL中增加hADSCs的量，在移植組織起輔助作用。在體外模擬成脂微環(huán)境發(fā)現(xiàn)，hADSCs成脂誘導(dǎo)6d，細胞內(nèi)開始出現(xiàn)細小脂滴，12d分化為脂肪細胞。細胞內(nèi)出現(xiàn)部分脂滴融

26、合，形態(tài)由細長型變?yōu)槎嘟切?。轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRNA及其蛋白隨時間逐步升高，后期達高峰，在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)節(jié)。PPARγmRNA及其蛋白參與中后期促進hADSCs成脂和脂肪細胞成熟。SREBP1mRNA與SRBPF1隨時間表達不一致，SRBPF1mRNA隨時間逐漸增高，說明SREBP1屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。兩者在體外整個hADSCs成脂分化中參與調(diào)節(jié)，促進脂肪細胞形成及其表型表達。
　　 2乳腺癌細胞旁分泌對hADSCs成脂時間無明顯

27、影響。其旁分泌因子影響hADSCs成脂過程中細胞內(nèi)成脂轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRNA、SREBF1mRNA及其表達產(chǎn)物。PPARγ無規(guī)律可循，SREBP1仍為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。充分說明細胞成脂分化仍受到微環(huán)境影響，部分呈抑制?？赡艽嬖谄渌穼PARγ抑制。但乳腺癌細胞脂肪轉(zhuǎn)運功能仍受SREBP1影響，在成脂環(huán)境中，脂肪細胞為乳腺癌細胞提供“能源”。
　　 3雖然轉(zhuǎn)錄因子相同，但在不同細胞中作用不同。hADSCs、MCF-7、BT474

28、和AC中，轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRNA在MCF-7和BT474表達較低，PPARγ在乳腺癌細胞中無表達，提示PPARγ在乳腺癌中影響細胞周期，間接反映細胞的惡性程度。轉(zhuǎn)錄因子aP2在hADSCs成脂誘導(dǎo)中主要影響PPRAγ的表達，具有促成脂作用;在乳腺癌腫瘤細胞中，與原癌基因結(jié)合，隨癌細胞惡性程度而呈現(xiàn)高表達。
　　 4 hADSCs成脂前后增強乳腺癌細胞侵襲性，與乳腺癌細胞、hADSCs、AC旁分泌VEGF、MMP2、MMP9、

29、uPA等細胞因子和蛋白酶有關(guān)[19-22]。hADSCs旁分泌影響較大。hADSCs分泌MMP2、MMP9為血管和細胞生長提供空間，溶解基質(zhì)后，可加速血管之間的連接，形成有效的循環(huán)，促進細胞生長。另一方面，對癌細胞來講，也提供血運轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。乳腺癌細胞自身分泌的uPA和VEGF是乳腺癌復(fù)發(fā)、浸潤和遠位轉(zhuǎn)移的細胞因子。MCF-7中細胞旁分泌大量的VEGF和uPA，兩者相互平行，是MVF-7復(fù)發(fā)和快速生長和遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。而BT474細

30、胞培養(yǎng)液中，uPA和VEGF不一致，VEGF分泌量多，uPA量少，與乳腺癌的病理類型有關(guān)，BT474容易在局部快速浸潤生長，早期血行轉(zhuǎn)移的可能性小[23]。AC中VEGF高表達可能是脂肪顆粒移植后組織的生長過程中血管形成和組織發(fā)育的關(guān)鍵因素之一，保持AC含量是脂肪組織成活的關(guān)鍵。同時也提供了“癌床”微環(huán)境腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的血管基礎(chǔ)。乳腺癌細胞不分泌MMP2，而hADSCs、AC分泌MMP2，由于腫瘤細胞的“竊取效應(yīng)”，hADSCs成脂前后對

31、乳腺癌細胞主要是局部影響[剮。整個成脂過程中，脂肪庫的增加，也為腫瘤細胞提供能源基礎(chǔ)，加強乳腺癌細胞的生長、浸潤以及轉(zhuǎn)移需要的能源動力。
　　 5 PPARγ蛋白在MCF-7、BT474中無表達，其影響腫瘤細胞周期，促進細胞增殖，處于低分化狀態(tài)，具有抑癌作用[24]。hADSCs成脂分化前后，PPARγ蛋白受到抑制，也許會影響hADSCs成脂分化。aP2在MCF-7、BT474均有表達，但MCF-7表達高，aP2與原癌基因結(jié)合，

32、促進癌細胞增殖、浸潤等[25]。aP2在腫瘤細胞中無法通過PPARγ調(diào)節(jié)細胞儲脂，但轉(zhuǎn)運脂肪能力增加，利用周圍脂肪微環(huán)境，低能量轉(zhuǎn)運脂肪，在“癌床”微環(huán)境下，為乳腺癌細胞代謝、轉(zhuǎn)移等提供能源。
　　 6低量的顆粒脂肪移植，hADSCs附著在脂肪顆粒支架上，可充分增加移植物和hADSCs早期與血漿的接觸，促進成活。細胞活性增加后，可為血管形成提供內(nèi)皮細胞分化基礎(chǔ)，增加VEGF分泌量，新生大量血管，為脂肪顆粒成活提供有效的血供。但在