microRNA-146a調(diào)控Toll樣受體4信號通路對神經(jīng)病理性疼痛的影響.pdf

1、目的：miR-146a是炎性免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一，其兩個主要靶基因IL-1相關(guān)蛋白激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase1，IRAK1)和腫瘤壞死因子受體活化因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF6)是Toll樣受體4(toll like receptor4，TLR4)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要銜接因子，而TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化與神經(jīng)病理性疼痛

2、密切相關(guān)。本課題擬檢測雙側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（bilateral chronic constriction injury,bCCI）大鼠L4-6背根神經(jīng)節(jié)(dorsal rootganglion，DRG)中microRNA-146a的表達變化及TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化情況，研究其對IRAK1和TRAF6參與疼痛相關(guān)TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用，并探討干預(yù)miR-146a表達后對bCCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛行為的影響，從而明確m i

3、R-146a對神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控機制。
　　方法：
　　1.檢測bCCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中miR-146a表達及TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化情況雌性SD大鼠，體重200-250g，采用隨機數(shù)字表法隨機分為①正常對照組(Na(i)ve)(N=12);②假手術(shù)組(Sham)(N=12):進行大鼠雙側(cè)假手術(shù)，僅暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)不結(jié)扎;③雙側(cè)坐骨神經(jīng)壓迫損傷組（bCCI組）(N=12):建立大鼠bCCI模型。在建模前1天、后1

4、、3、7、14及21天監(jiān)測3組大鼠機械刺激誘發(fā)痛、熱刺激誘發(fā)痛行為學(xué)指標。實時定量PCR法檢測大鼠L4-6 DRG中TLR4和miR-146a及其靶基因IRAK1、TRAF6的mRNA表達水平;Western-blot法檢測TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TLR4、MyD88、TRIF、IRAK1、TRAF6、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達水平變化;免疫組化對TLR4、IRAK1和TRAF6定位檢測。ELISA檢測不同時間點三組大鼠DRG中I

5、L-6和TNF-α的表達水平。
　　2.干預(yù)miR-146a表達對bCCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛行為學(xué)影響及其分子機制雌性SD大鼠，體重200-250g，采用隨機數(shù)字表法隨機分為①miR-146a過表達處理組(agomir-146a)(n=6);②miR-146a低表達處理組(antagomir-146a)(n=6);③陰性對照組（negative control，NC）(n=12)。各組均行雙側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫手術(shù)，于手術(shù)當天及

6、術(shù)后第3、5、7、10天分別經(jīng)鞘內(nèi)注射容量為10μl的agomiR-146a或antagomiR-146a及相應(yīng)對照試劑（5nmol溶于生理鹽水），于術(shù)前及術(shù)后第1、3、7、14天進行動物行為學(xué)評估，觀察大鼠對機械和熱刺激的反應(yīng)。實時定量PCR法檢測術(shù)后第14天大鼠L4-6DRGmiR-146a及IRAK1、TRAF6的mRNA表達水平;Western-blot法檢測IRAK1、TRAF6蛋白表達水平變化。培養(yǎng)DRG神經(jīng)元原代細胞，分別

7、孵育agomiR-146a、antagomiR-146a及對照試劑24小時后利用鈣成像技術(shù)觀察各組細胞LPS刺激后細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流情況。
　　結(jié)果：
　　1.與Na(i)ve組及Sham組相比，bCCI組大鼠L4-6 DRG中miR-146a在建模后第3天降低，第7天達最低值，第21天恢復(fù)基線水平。IRAK1和TRAF6的mRNA和蛋白水平均明顯升高，且3組在不同時間點具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組化證實IRAK1和

8、TRAF6均在DRG神經(jīng)元細胞上表達，且IRAK1以在肽能神經(jīng)元上表達為主(52.3％)，而TRAF6則較多表達在非肽能神經(jīng)元上(63％)。
　　2.與Na(i)ve組及Sham組相比，bCCI組大鼠L4-6 DRG中TLR4 mRNA水平顯著升高，三組在不同時間點具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平升高(P＜0.05)，TRIF蛋白水平無明顯改變(P＞0.05)。免疫組化證實T

9、LR4在DRG神經(jīng)元細胞上表達;ELISA結(jié)果提示相比Na(i)ve組及Sham組，bCCI組大鼠DRG中IL-6和TNF-α表達水平增加(P＜0.05)。
　　3.與NC組相比，agomiR-146a組bCCI大鼠機械刺激閾值和熱輻射刺激閾值均升高，各組不同時間點差異具體統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。agomiR-146a組bCCI大鼠L4-6 DRG中miR-146a表達量顯著上調(diào)，IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白水平均顯

10、著下降(P＜0.05)。與NC組相比，antagomiR-146a組bCCI大鼠疼痛行為學(xué)機械刺激和熱刺激閾值無統(tǒng)計學(xué)差異。antagomiR-146a組bCCI大鼠L4-6DRG中miR-146a表達下調(diào)，IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白水平均顯著增加(P＜0.05)。原代DRG神經(jīng)元細胞鈣成像結(jié)果顯示agomiR-146a可有效減少細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流陽性率(1.59％)，而antagomiR-146a組細胞內(nèi)鈣離子增加(12.5