過氧化物酶體增殖物激活受體δ在大鼠角膜準(zhǔn)分子激光切削術(shù)后的抗纖維化作用.pdf

1、目的:
　　角膜渾濁是造成視力下降的重要原因之一。角膜創(chuàng)傷愈合過程中，肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)和異常角膜基質(zhì)的形成是角膜纖維化的重要原因。糖皮質(zhì)激素和絲裂霉素C可以抑制角膜纖維化，但具有明顯副作用。因此，研發(fā)安全有效的抗纖維化藥物極為必要。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)δ在細(xì)胞增殖、分化和組織創(chuàng)傷愈合等方面具有重要作用。研究證實(shí)PPARδ激動(dòng)劑抑制血管平滑肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，并通過抗炎作用減輕肝纖維化。但目前

2、關(guān)于PPARδ是否具有抗角膜基質(zhì)纖維化作用方面尚無相關(guān)研究。本工作利用準(zhǔn)分子激光切削角膜造成基質(zhì)損傷，應(yīng)用GW501516激活PPARδ，觀察GW501516對(duì)角膜創(chuàng)傷愈合的影響，首次實(shí)驗(yàn)并探討PPARδ的抗角膜基質(zhì)纖維化作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.利用準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)(PTK)切削SD大鼠的中央角膜，切削直徑4.5mm，切削深度50μm或70μm。術(shù)后裂隙燈檢查對(duì)比角膜渾濁度，選擇合適的切削深度。角膜共聚焦

3、顯微鏡檢查及HE染色檢查評(píng)估角膜創(chuàng)傷愈合反應(yīng)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分4組，分別球結(jié)膜下注射PBS，GW501516（PPARδ激動(dòng)劑），GSK3787（PPARδ拮抗劑）或GW501516聯(lián)合GSK3787。術(shù)后給藥每周2次直到處死大鼠。
　　3.術(shù)后裂隙燈檢查眼表情況:術(shù)后早期利用熒光素染色法觀察上皮愈合情況，術(shù)后每周觀察角膜新生血管情況，進(jìn)行中央角膜渾濁度評(píng)分，共觀察4周。
　　4.術(shù)后1周、2周及4周，共聚焦顯微鏡觀察

4、活體角膜基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的變化。觀察并對(duì)比各組前部角膜基質(zhì)的相對(duì)反光強(qiáng)度。
　　5.術(shù)后2周及4周，HE染色法觀察角膜組織愈合情況并對(duì)中央角膜的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　6.術(shù)后2周及4周，免疫熒光染色法檢測(cè)角膜組織中α-SMA、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)。
　　7.術(shù)后4周，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Ki67抗原、α-SMA、Ⅲ型膠原、Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.利用

5、PTK切削SD大鼠的中央角膜，切削直徑4.5mm，切削深度70μm，該方法安全有效，可獲得理想的角膜渾濁程度并引起角膜損傷修復(fù)反應(yīng)。
　　2.激活PPARδ延遲角膜上皮愈合:術(shù)后24和48小時(shí)，GW501516組角膜上皮缺損面積大于其它各組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.激活PPARδ促進(jìn)角膜新生血管形成:術(shù)后1周及2周，GW501516組角膜新生血管面積大于其它各組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.激活PPARδ改善角膜透明度

6、:術(shù)后4周，GW501516組角膜渾濁度評(píng)分較GSK3787組低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.激活PPARδ抑制基質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖:術(shù)后4周，共聚焦顯微鏡活體檢查見GW501516組基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)安靜，細(xì)胞外基質(zhì)反光較低;GSK3787組基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)活躍，細(xì)胞外基質(zhì)反光較強(qiáng)。和其他各組相比，GW501516組前部基質(zhì)相對(duì)反光強(qiáng)度降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；|(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)示GW501516組基質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯低于PBS組和GSK3787組，具有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，GW501516組角膜基質(zhì)的Ki67抗原mRNA表達(dá)較其它各組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.激活PPARδ抑制基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞:術(shù)后2周，免疫熒光染色證實(shí)前部及中部角膜基質(zhì)內(nèi)存在α-SMA陽性細(xì)胞，各組間未見明顯差異。術(shù)后4周，GW501516組的α-SMA mRNA較其它各組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.激活PPARδ抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成:術(shù)后4周，同PBS組和GSK3787組相比，免疫熒光染

8、色證實(shí)GW501516組的Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白表達(dá)降低。同時(shí)，GW501516組中Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)均明顯下降，和其他各組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　PPARδ激動(dòng)劑在角膜組織創(chuàng)傷愈合中有抗纖維化作用，它能抑制基質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖，降低基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，緩解基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，減少細(xì)胞外基質(zhì)合成。從而在基質(zhì)重塑期改善角膜透明度。但PPARδ激動(dòng)劑延遲角膜上皮愈合并促進(jìn)角膜新生血管形