下調前列腺干細胞抗原表達對人前列腺癌細胞PC-3M生長及侵襲轉移的體內研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤。我國前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更為迅速，已成為泌尿外科領域一個越來越重要的課題。前列腺癌具有侵襲性生長的生物學特性，臨床上有許多患者就診時已經(jīng)有癌的擴散轉移，而相當多數(shù)局限性前列腺癌患者在以治愈為目的的根治性治療（根治性前列腺切除術、根治性放療）后幾乎不可避免地發(fā)生生化復發(fā)，并最終進展為遠處轉移。侵襲和轉移性生長目前仍然是前列腺癌患者死亡的主要原因。因此，深

2、入闡明前列腺癌發(fā)生侵襲和轉移的分子機制，尋找新的干預靶點，為前列腺癌的治療提供新的途徑具有重要意義。前列腺干細胞抗原（PSCA）基因是首次從人前列腺癌異種移植瘤動物模型LAPC-4鼠中分離得到的一個新基因，并特異性表達于前列腺癌組織中。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)PSCA基因表達不僅與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關，而且與臨床前列腺癌的惡性進展密切相關。我們前期體外實驗已證實利用RNAi技術抑制PSCA基因表達，可抑制PC-3M細胞的增殖及侵襲轉移能力。

3、本實驗進一步研究其在生物體內中的作用，通過篩選穩(wěn)定沉默PSCA的前列腺癌細胞株PC-3M-PSCA(-)，將其接種在重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠皮下，觀察PSCA-shRNA對移植前列腺癌生長、侵襲及轉移的影響。
　　研究目的：
　　觀察shRNA介導沉默PSCA表達對SCID鼠荷人前列腺癌皮下移植瘤的影響，從而探討shRNA靶向沉默PSCA基因在轉移性前列腺癌治療中的意義。
　　研究內容和方法：
　　1、利

4、用脂質體轉染法將質粒pGPU6/GFP/Neo shRNA-PSCA轉染到內源性高表達PSCA的前列腺癌PC-3M細胞中，熒光顯微鏡動態(tài)觀察，G418加壓篩選單克隆細胞株，用蛋白質印跡技術鑒定并最終篩選單克隆前列腺癌細胞株。
　　2、將穩(wěn)定沉默PSCA的細胞株接種于SCID鼠皮下，動態(tài)觀察其致瘤性及移植瘤的生長情況，并測量腫塊的長徑(a)和短徑(b)，按公式 V=a*b2/2計算移植瘤的體積，繪制移植瘤生長曲線。
　　3、四

5、周后，先行3.0T MR掃描，再處死并解剖小鼠，肉眼觀察全身組織和器官發(fā)生粘連及轉移的情況，記錄各組發(fā)生轉移的動物的只數(shù)、轉移的臟器以及轉移灶的數(shù)量。
　　4、完整剝離腫瘤及分離MRI顯示可疑轉移器官，4％多聚甲醛液固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學分析。
　　結果：
　　1、成功構建表達綠色熒光且穩(wěn)定沉默 PSCA表達的單克隆前列腺癌細胞株PC-3M-PSCA(-)，PSCA蛋白抑制率為（77.48±3.73）%。

6、r>　　2、干擾組（shRNA組）的初始致瘤時間和完全致瘤時間較C組及NC組長；接種細胞第10天，shRNA組的成瘤率為40%（2/5只），較空白對照組（C組）的成瘤率100%（5/5只）、無關序列轉染組（NC組）的成瘤率80%（4/5只）均降低，但三組小鼠間移植瘤的體積（8.34±3.58mm3、23.38±32.04 mm3、3.24±5.26 mm3）無明顯差異（P=0.254）；第17天，三組小鼠全部致瘤，但shRNA組移植瘤體

7、積（49.44±32.03 mm3）顯著小于其余兩個對照組（409.32±203.01 mm3和333.58±149.74 mm3）（P=0.005），而對照組間無顯著性差異（P=0.431）；移植瘤生長曲線分析亦表明：自接種細胞第17天，干擾組移植瘤的生長被顯著抑制，與對照組比較具有顯著性差異（P=0.031），而對照組間無顯著差異（P=0.902）。
　　3、MRI及大體解剖結果顯示，shRNA組發(fā)生侵襲轉移的小鼠數(shù)量、轉移灶