6種靶向分子對(duì)Faeg-mSTa-LTB-STb融合蛋白包涵體口服免疫效果的影響.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要疾病，其發(fā)病率高，危害相當(dāng)嚴(yán)重，會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中的一個(gè)難題。產(chǎn)腸毒索性大腸桿菌則是造成斷奶仔豬腹瀉的重要病原體，根據(jù)近年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在菌毛基因中，F(xiàn)4+ETEC占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。在腸毒素基因中，STa、STb、LT是最重要的毒力因子。目前應(yīng)對(duì)仔豬腹瀉主要依靠藥物治療，其中大多數(shù)為抗生素類(lèi)藥物，抗生素類(lèi)藥物容易產(chǎn)生耐藥性，并且濫用抗生素對(duì)仔豬產(chǎn)生極大的影響，所以，研制開(kāi)發(fā)出

2、經(jīng)濟(jì)、有效的疫苗來(lái)預(yù)防斷奶仔豬腹瀉是極其必要的。
　　本研究首先采用融合PCR的方法得到FaeG-mSTa-LTb-STb四價(jià)抗原基因，并將該融合基因連接到pProEXHTa表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot分析顯示，融合基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)并以包涵體形式存在，并且具有反應(yīng)原性。為研究融合蛋白的免疫原性，本實(shí)驗(yàn)利用提取純化后的包涵體直接口服免疫BALB/c小鼠，分別測(cè)

3、定免疫后不同時(shí)間血清中的特異性IgG、IgM和糞便中特異性的sIgA抗體水平，并進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，攻毒后從糞便檢測(cè)排菌的持續(xù)時(shí)間，在末次免疫3個(gè)月后，測(cè)定黏膜免疫記憶反應(yīng)。結(jié)果顯示，免疫小鼠均產(chǎn)生了特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，攻毒后排菌時(shí)間明顯縮短。免疫記憶反應(yīng)試驗(yàn)表明，免疫鼠至少在3個(gè)月內(nèi)保持著對(duì)特異性抗原的免疫記憶應(yīng)答，證實(shí)了包涵體作為口服疫苗的傳遞載體是有效的。
　　為了提高該四價(jià)抗原基因的免疫效果，本研究利用PCR的方

4、法分別在該融合基因的3'端加入C5aL、Cpe17、Cpe30、YadA3、sfimH的靶向分子，用于增強(qiáng)抗原傳遞效率，加強(qiáng)免疫效果，在單靶向基因構(gòu)建成功后，同樣利用PCR的方法，在該各組單靶向抗原的5'端加入DCpep靶向分子，構(gòu)建雙靶向融合基因，靶向樹(shù)突狀細(xì)胞，更進(jìn)一步增強(qiáng)免疫效果。利用SDS-PAGE、Western blot方法分析各單、雙靶向分子組，各重組基因均可在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并以包涵體的形式存在，具有反應(yīng)原性。

5、r>　　為了比較不同靶向分子之間的免疫效果，選擇增強(qiáng)效果最好的靶向分子，本實(shí)驗(yàn)口服各組包涵體免疫BALB/c小鼠，分別測(cè)定免疫后不同時(shí)間血清中的特異性IgG、IgM和糞便中特異性的sIgA抗體水平，并進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，攻毒后檢測(cè)糞便排菌的持續(xù)時(shí)間。結(jié)果顯示，除sfimH靶向分子組外，其它單、雙靶向分子組抗體水平顯著高于無(wú)靶向組。但單、雙靶向分子組之間相似，除YadA3組外，其他組單、雙靶向分子之間無(wú)明顯抗體水平差異。攻毒后各組特異

6、性抗體水平均有升高，各組小鼠排菌時(shí)間比對(duì)照組均明顯縮短。脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組增殖刺激指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組。
　　這說(shuō)明了C5aL、Cpe17、Cpe30、YadA3靶向分子具有免疫增強(qiáng)的功效。但這些靶向分子與DCpep靶向分子不全具有協(xié)同作用，只有YadA3靶向分子與DCpep靶向分子具有協(xié)同作用，從而更好的提高了免疫效果。
　　在選擇最好的靶向分子組合后，我們進(jìn)行了仔豬免疫實(shí)驗(yàn)，分別通過(guò)口服免疫、鼻腔滴鼻免疫

7、、注射免疫三種不同的方式進(jìn)行免疫，經(jīng)過(guò)兩次免疫后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，在二免后7d、攻毒后7d分別對(duì)各組免疫方式的仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血，利用間接ELISA的方法測(cè)定血清中的IgG抗體水平。并在攻毒實(shí)驗(yàn)前后觀察仔豬發(fā)病情況、糞便排菌情況、日增重情況。
　　結(jié)果表明，在二免7d后及攻毒7d后，各實(shí)驗(yàn)組仔豬均產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平，相比于對(duì)照組差異極顯著（p＜0.01）。其中口服YadA3-DT組抗體水平明顯高于口服無(wú)靶向組，差異極顯著（p

8、＜0.01）。攻毒后，對(duì)照組發(fā)病快，腹瀉明顯，而免疫組發(fā)病現(xiàn)象不明顯，無(wú)腹瀉出現(xiàn)，并且排菌時(shí)間明顯比對(duì)照組短，日增重多。這說(shuō)明了該四價(jià)融合抗原在三種不同的免疫方式下均可在仔豬體內(nèi)誘導(dǎo)較高水平特異性免疫反應(yīng)，在一定程度上可以保護(hù)仔豬不被ETEC感染，并且雙靶向分子免疫增強(qiáng)作用得到了證實(shí)。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的FaeG-mSTa-LTb-STb四價(jià)抗原具有良好的免疫原性，證實(shí)了口服包涵體免疫是一種可行的免疫方式，各種靶向分子均有