以LTb為分子內佐劑的PRRSV-gp5蛋白免疫特性研究.pdf

1、本研究對PRRSV新型疫苗設計進行了新的探索，構建了以LTb為分子內佐劑的PRRSV-GP5融合蛋白，經(jīng)動物免疫試驗，闡明LTb的分子佐劑作用，為研究新型PRRS疫苗探尋新途徑。主要研究內容如下： 1.PRRSV ORF5基因的克隆、表達與免疫印跡將PRRSV ORF5基因克隆入原核表達載體pET-28a(+)的多克隆位點中，經(jīng)鑒定后得到重組質粒pET-ORF5，將重組質粒轉化到受體菌BL21(DE3)中，并用誘導劑IPTG進行

2、誘導表達，2小時后表達量達到高峰。經(jīng)15％SDS-PAGE電泳檢測，表達得到的蛋白大小為13.75KD。經(jīng)western Blotting分析，表達蛋白能與PRRSV陽性豬血清發(fā)生特異性反應，而與陰性血清不反應。 2.E coli LTb與PRRSV gp5融合基因克隆，表達與免疫印跡采用PCR重疊延伸技術將LTb和PRRSV ORF5基因通過柔性連接進行融合后，克隆入原核表達載體pET-28a(+)的多克隆位點中，經(jīng)鑒定后得到

3、重組質粒pET-LTb-gp5，將重組質粒轉化到受體菌BL21(DE3)中，并用誘導劑IPTG進行誘導表達，表達蛋白2小時后表達達到高峰。經(jīng)15％SDS-PAGE電泳檢測，表達得到的蛋白大小為26KD。經(jīng)Western Blotting分析，表達蛋白均能與PRRSV陽性豬血清發(fā)生特異性反應，而與陰性血清不反應。 3.gp5蛋白與LTb-gp5融合蛋白免疫效果的比較將表達產(chǎn)物gp5蛋白及融合表達的LTb-gp5蛋白免疫6-8周齡I

4、CR小鼠，并設對照組用間接ELISA法和MTT法檢測小鼠血清中特異性抗體水平以及脾臟中T、B淋巴細胞增殖功能。結果gp5蛋白以肌肉注射途徑免疫效果較好；三免后gp5特異性抗體達到較高水平，其中LTb-gp5 IM與gp5+氟氏佐劑組之間差異不顯著，而這兩組與gp5 IM差異顯著；從抗體種類來說，LTb-gp5三免后達到和gp5+氟氏佐劑組相同的三種抗體亞型，而gp5 IM仍然是一種抗體亞型。Lab-gp5 IM、gp5+氟氏佐劑組和gp

5、5 IM均能夠誘導脾臟T，B淋巴細胞增殖；LTb-gp5 IM、gp5+氟氏佐劑組均顯著高于gp5 IM。 4.大腸桿菌LTb蛋白單克隆抗體的制備和鑒定將大腸桿菌不耐熱腸毒素LTb基因去除信號肽后與載體pPIC9K連接，電轉化入酵母菌SMD1168中進行誘導表達。用純化的LTb表達蛋白免疫6周齡BALB/c鼠3次，取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合后，以間接ELISA和有限稀釋法進行篩選，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗大腸桿菌LTb單