PRRSV GP5蛋白基因疫苗的構(gòu)建及鑒定和三種分子佐劑的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是能夠引起妊娠母豬繁殖障礙和嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)癥狀的一種傳染性疾病，本病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），主要靶細(xì)胞是豬肺泡巨噬細(xì)胞。主要傳播途徑是空氣傳播、接觸感染和精液傳播，該病毒具有極強(qiáng)的傳染性，常常給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。糖基化囊膜蛋白（GP5）含有2-4個(gè)糖基化位點(diǎn)，是病毒的主要保護(hù)性中和抗原，其

2、誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，能夠中和病毒，使病毒失去感染性，是新型基因疫苗設(shè)計(jì)的主要靶蛋白。
　　基因疫苗又稱為DNA疫苗，即將外源性抗原基因連接到真核表達(dá)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主體內(nèi)，并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。一定時(shí)限內(nèi)，抗原基因在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，激活機(jī)體免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。與滅活疫苗、弱毒疫苗等相比基因疫苗具有生產(chǎn)成本低、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸、持續(xù)性強(qiáng)、使用安全等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于疾

3、病作用顯著，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但是核酸疫苗也有抗體產(chǎn)生慢、水平低等問題，配以有效佐劑是克服這些問題的有效途徑之一。
　　第二信使c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP作為在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子，在細(xì)菌的致病力、細(xì)胞壁的代謝平衡、細(xì)菌的生長(zhǎng)以及生物膜形成等方面起到至關(guān)重要的作用，在真核生物體內(nèi)，能夠作為信號(hào)分子被宿主識(shí)別，激活先天免疫應(yīng)答。第二信使作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能夠很好的調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，因

4、此，可成為具有潛力的免疫佐劑。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了PRRSV GP5基因調(diào)控型真核表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)做了研究，摸索了c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’ cGAMP的制備及純化方法，具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1. PRRSV GP5基因調(diào)控型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　提取實(shí)驗(yàn)室保存的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的總RNA，RT-PCR擴(kuò)增的到GP5基因cDNA，克隆到基因調(diào)控型表達(dá)載體pXJ41上，

5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransT1感受態(tài)，經(jīng)過酶切鑒定后測(cè)序，沒有堿基突變，得到pXJ41-GP5重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞當(dāng)中，經(jīng)間接免疫熒光和Western Blot實(shí)驗(yàn)證明，pXJ41-GP5重組質(zhì)粒，能夠在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　2. c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’ cGAMP的制備及檢測(cè)方法
　　分別挑取含有霍亂弧菌VCA0956（合成c-di-GMP所必需的酶蛋白），VC0179（合成c-di-AMP所必

6、需的酶蛋白）基因，以及含有mcGAS（合成2’-3’cGAMP所必需的酶蛋白）基因表達(dá)序列的大腸桿菌菌株，16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NTA親和層析制備VCA0956、VC0179、mcGAS三種酶蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE驗(yàn)證確定得到的蛋白即為目的蛋白，然后經(jīng)分子篩層析純化三種酶蛋白。在酶和底物存在的情況下，根據(jù)c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP的反應(yīng)式，建立酶促反應(yīng)體系，制備三種分子佐劑，經(jīng)過摸索反相高效液相