PRRSV的分離鑒定和VLPs的構(gòu)建.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，主要引起母豬流產(chǎn)及仔豬呼吸系統(tǒng)障礙，其高發(fā)病率和致死率給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前防控PRRS的措施除了嚴(yán)格的生物安全措施外，最有效的辦法就是疫苗接種。臨床上主要采用滅活疫苗和弱毒疫苗預(yù)防免疫，但其存在免疫效果差和返毒等缺陷，使得人們的

2、目光不得不轉(zhuǎn)向其他新型疫苗的研制以控制PRRS的發(fā)生和流行。本研究通過對PRRSV重慶株的分離鑒定，選取其GP5和M基因，構(gòu)建PRRS病毒樣顆粒（Virus-like Particles,VLPs），在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫活性的評估，為研制PRRS的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　1.重慶株P(guān)RRSV的分離鑒定
　　從重慶某豬場采集病死豬病料，經(jīng)RT-PCR初步鑒定其病原為PRRSV后，利用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計NSP2和GP5基因片

3、段的特異性引物，并對其擴(kuò)增，序列測序，分析鑒定。結(jié)果表明，該分離株的NSP2基因與經(jīng)典毒株VR-2332核苷酸同源性僅為66.7％，與高致病變異株SD、JXA1的核苷酸同源性高達(dá)98.8%，GP5基因在個別堿基上也存在變異，由此表明該毒株為高致病性（High Pathogenicity，HP）PRRSV變異株。同時將該病料接種于Marc-145細(xì)胞，可觀察到典型的細(xì)胞病變（cytopathic effect,CPE)，經(jīng)Reed-Mue

4、nch計算該分離株的病毒滴度為10-5.67 TCID50/0.1 mL。
　　2.PRRSV-VLPs的構(gòu)建
　　為構(gòu)建HP-PRRSV病毒樣顆粒（VLPs）疫苗，本研究以分離鑒定的HP-RRSV重慶株（CQ）的GP5和M全部編碼基因?yàn)槟０?，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，共表達(dá)GP5和M蛋白，并采用SDS-PAGE、Western blotting對重組蛋白進(jìn)行定性分析；蔗糖梯度離心進(jìn)行純化；通過電子透射顯微鏡對VLPs

5、進(jìn)行直觀的形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果表明：利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠成功的共表達(dá)GP5和M蛋白，并能自動裝配成VLPs，并顯示具有與天然蛋白類似的免疫原性；電鏡觀察到VLPs的形態(tài)與文獻(xiàn)中描述一致，直徑約50 nm。
　　3.PRRSV-VLPs免疫活性測定
　　BALB/c小鼠肌肉三次注射不同劑量（5.0，10.0，20.0，50.0，100.0μg）的PRRSV-VLPs疫苗，用商用的滅活疫苗做陽性對照，無菌的生理鹽水做陰

6、性對照。結(jié)果顯示陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組GP5抗體滴度顯著高于陰性對照；在免疫劑量50.0、100.0μg PRRSV-VLPs的小鼠血清中檢測到中和抗體；實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組都檢測到細(xì)胞因子水平，其中，免疫20.0μg PRRSV-VLPs小鼠的IL-4水平顯著高于其他組；免疫50.0μg PRRSV-VLPs小鼠的IFN-γ水平顯著高于其他組；整體規(guī)律不明顯。這些數(shù)據(jù)表明PRRSV-VLPs能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫，是預(yù)