HP-PRRSV GP5蛋白在酵母中的高效分泌表達及抗體檢測iELISA方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病，給世界各國帶來了嚴重的經濟損失。而高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)是PRRS經典毒株的變異毒株，自2006年爆發(fā)以來，給養(yǎng)殖場造成的損失更是毀滅性的。因此，建立快捷、敏感的診斷方法對提前預防該疾病，及時采取控制措施具有重要意義。GP5蛋

2、白作為PRRSV病毒的主要結構蛋白，成為血清學檢測的重要目標蛋白。巴斯德畢赤酵母作為一種高效表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，己被廣泛應用。本實驗將通過畢赤酵母表達系統(tǒng)高效分泌表達去跨膜區(qū)的GP5(dGP5)蛋白，并基于該蛋白建立檢測GP5蛋白抗體的間接ELISA方法。
　　首先，本研究主要通過密碼子的偏嗜性、AT富含區(qū)、GC含量調整等對HP-PRRSV HuN4 GP5基因進行優(yōu)化。在前期研究中，將編碼同樣氨基酸的HuN4野生型GP5

3、基因與優(yōu)化的GP5基因通過EcoRI和NotI雙酶切后，插入到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K中。重組質粒經過SacI線性化后兩次電轉畢赤酵母菌株GS115中。經過MD板和不同濃度的YPD-G418板篩選出PCR陽性菌株，但發(fā)現蛋白均未在畢赤酵母中分泌表達。進一步將dGP5基因進行優(yōu)化并以同樣的方法在畢赤酵母中進行分泌表達，成功篩選到高效分泌表達的菌株。為摸索重組蛋白最佳誘導表達條件，從不同的方面對dGP5蛋白的表達條件進行優(yōu)化，如表

4、達時間、甲醇誘導濃度、pH值、溫度等。并通過SDS-PAGE和Western-blotting對蛋白進行鑒定。結果表明:優(yōu)化的dGP5基因在畢赤酵母中成功表達，經過基因優(yōu)化后，氨基酸序列與優(yōu)化前一致，修改堿基75 bp，優(yōu)化后基因與原序列核苷酸同源性為76.9％，涉及62個氨基酸密碼子的改變，G+C含量由49.69％變?yōu)?2.28％。經過外界誘導條件的優(yōu)化后，確定最佳誘導條件為轉速250 r/min，pH為6.5，溫度為24℃，甲醇誘導

5、濃度為1％，表達時間為120 h。經過SDS-PAGE和Western-blotting鑒定，目的帶大小為19KDa左右。
　　其次，通過His柱對蛋白進行純化并利用純化好的dGP5蛋白作為包被抗原，進行間接ELISA方法的建立。實驗結果表明:抗原最佳包被濃度為0.21μg/孔，4℃過夜。血清最佳稀釋度為100倍，作用37℃1h。酶標抗體進行1∶40000倍稀釋，作用37℃1h。與PPV、RV、PRV、CSFV、和TEGV均無交叉