內(nèi)皮祖細胞移植對大鼠短暫性大腦中動脈栓塞治療作用及機制的初步研究.pdf

1、背景：
　　 在缺血性腦血管病的治療研究中，神經(jīng)保護理論在基礎研究和動物實驗中都取得了較好的效果，但臨床試驗無明顯療效。溶栓治療可有效恢復局部腦血流供應、挽救缺血半暗帶組織，促進神經(jīng)功能恢復，但由于時間窗過短(≤4.5h)限制了臨床廣泛應用。因此，研究者的眼光從單純神經(jīng)或血管的保護擴展到了神經(jīng)血管單元保護的策略。2003年，ABPN提出設立血管神經(jīng)病學專業(yè)的申請并得到了批準[1]。此后，人們開始把保護神經(jīng)血管單元的研究作為解決腦

2、缺血治療困境的重要策略之一。
　　 在有關神經(jīng)血管單元保護策略的研究中，人們改變了以往過多關注神經(jīng)元或血管保護的理念，開始把神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、微血管內(nèi)皮細胞及基質(zhì)之間的相互作用作為一個整體來看待。其中，EPCs作為研究這一策略的途徑之一，也已成為了大家關注的熱點。EPCs移植可以在修復血管內(nèi)皮損傷、促進血管生成(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)方面發(fā)揮保護作用，這一結果已得到了動物實驗的驗證[

3、2、3]。同時，也有學者通過總結前人的實驗研究推測[4]，EPCs移植還可能通過旁分泌細胞因子(VEGF、BDNF、HGF等)發(fā)揮神經(jīng)保護作用，而且這一作用是獨立于血管生成和血管發(fā)生作用以外的。結合以上觀點，我們推測，EPCs移植有可能對神經(jīng)血管單元發(fā)揮保護作用，而這一保護作用的重要機制之一是通過EPCs旁分泌VEGF介導的。
　　 VEGF稱為血管內(nèi)皮生長因子，它通過與受體結合促進內(nèi)皮細胞增殖和新生血管形成。進一步研究表明，在

4、神經(jīng)細胞的應激狀態(tài)下(如缺氧、葡萄糖剝奪等)，VEGF有神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用[5]。這一作用可能是通過抑制神經(jīng)細胞凋亡、促進神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生等途徑實現(xiàn)。已有的實驗證實，體外培養(yǎng)的EPCs有分泌VEGF的作用[6]。但是，EPCs在體研究，即通過EPCs移植能否對腦缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用？其作用機制是什么？目前對這些問題的研究尚未取得一致意見。
　　 為此，我們的實驗從EPCs可以在體外分泌VEGF的研究基礎入手，通過構建大

5、鼠tMCAO模型，經(jīng)頸內(nèi)動脈移植EPCs，采用免疫組織化學方法觀察EPCs移植后是否能在缺血局部腦組織定位并旁分泌VEGF，并采用免疫組織化學、分子生物學等技術，觀察不同時相皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡及VEGF、caspase-3表達水平變化，探討三者之間變化的關系，旨在初步闡明EPCs移植對大鼠tMCAO模型的治療作用及其機制，為臨床缺血性腦血管疾病的治療提供新的方法及理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 觀察EPCs經(jīng)頸內(nèi)動脈移植對t

6、MCAO大鼠腦缺血損傷的保護作用，并初步探討其機制。
　　 方法：
　　 (1)分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠骨髓來源EPCs；(2)建立大鼠tMCAO模型；(3)經(jīng)頸內(nèi)動脈移植EPCs到tMCAO大鼠，設立PBS經(jīng)頸內(nèi)動脈注射作為對照；(4)觀察如下指標：①采用干細胞染色示蹤技術，觀察EPCs能否定位于缺血局部腦組織；②采用普通HE染色觀察大鼠缺血部位病理變化；③分別于移植后的第1、3、5、7天采用TUNEL法觀察皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡

7、變化、免疫組化法檢測VEGF、Caspase-3表達變化、Western Blot檢測缺血局部腦組織VEGF表達量的變化。
　　 結果：
　　 1、分離的大鼠骨髓來源單核細胞，經(jīng)過VEGF、bFGF的誘導分化，培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出典型的“血島樣”集落、“鋪路石”樣細胞形態(tài)，具有吞噬DiI-ac-LDL功能，CD34和vWF細胞免疫熒光染色陽性。提示分離培養(yǎng)的細胞為EPCs。
　　 2、EPCs吞噬DiI-ac-LDL

8、染色后胞漿呈紅色熒光，經(jīng)頸內(nèi)動脈移植到大鼠tMCAO模型，3天后冰凍切片觀察缺血局部腦組織，可以在毛細血管壁見到大量紅色熒光細胞，在正常腦組織少見紅色熒光細胞。PBS對照組缺血局部腦組織毛細血管壁未見紅色熒光細胞。提示經(jīng)內(nèi)頸動脈注射，EPCs可以定位于缺血腦組織。
　　 3、頸內(nèi)動脈移植EPCs對tMCAO大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響：通過TUNEL法，觀察缺血部位神經(jīng)元凋亡，發(fā)現(xiàn)PBS頸內(nèi)動脈注射對照組陽性細胞第1、3、5天分別為

9、(105.72±2.69)、(132.96±2.88)、(145.12±3.22)，隨時間延長逐漸升高且與前一時相點相比有顯著差異(P<0.05)；而EPCs移植組陽性細胞數(shù)分別為(91.84±3.21)、(82.08±2.77)、(54.68±3.12)，隨時間延長逐漸降低且與前一時相點相比有顯著差異(P<0.05)。與對應時相比較，經(jīng)頸內(nèi)動脈注射EPCs后大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)量均明顯少于PBS對照組(P<0.05)。提示經(jīng)頸內(nèi)動脈移

10、植EPCs可以明顯減少tMCAO大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡。
　　 4、頸內(nèi)動脈移植EPCs對tMCAO大鼠皮質(zhì)Caspase-3表達的影響：通過免疫組化法，觀察缺血部位神經(jīng)元Caspase-3表達陽性細胞數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)PBS對照組陽性細胞數(shù)第1、3、5天分別為(81.48±3.80)、(103.00±2.73)、(122.92±2.65)，隨時間延長逐漸增加且與前一時相點相比有顯著差異(P<0.05)；經(jīng)頸內(nèi)動脈EPCs移植組Cas

11、pase-3陽性細胞數(shù)分別為(71.88±2.55)、(60.84±3.06)、(31.24±2.73)，隨時間延長逐漸減少且與前一時相點相比有顯著差異(P<0.05)。與對應時相PBS對照組比較，經(jīng)頸內(nèi)動脈注射EPCs后大鼠皮質(zhì)Caspase-3陽性細胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)。提示經(jīng)頸內(nèi)動脈移植EPCs可以明顯抑制tMCAO大鼠Caspase-3表達。
　　 5、頸內(nèi)動脈移植EPCs對tMCAO大鼠缺血局部腦組織VEGF

12、表達的影響：通過免疫組化法，從形態(tài)學上發(fā)現(xiàn)EPCs移植組有較多VEGF陽性細胞，而PBS對照組對應區(qū)域少見VEGF陽性細胞。進一步應用Western Blot觀察缺血局部腦組織VEGF蛋白表達量變化發(fā)現(xiàn)：PBS對照組VEGF表達量第1、3、5天分別為(0.21±0.02)、(0.34±0.03)、(0.29±0，05)，隨時間延長呈不穩(wěn)定的低水平表達；而EPCs移植組VEGF蛋白表達量分別為(0.47±0.02)、(0.56±0.01)

13、、(0.99±0.03)，隨時間延長逐漸增加且與前一時相點相比有顯著差異(P<0.05)。與對應時相PBS對照組比較，經(jīng)頸內(nèi)動脈注射EPCs后大鼠缺血局部腦組織VEGF表達量均顯著增加(P<0.05)。提示經(jīng)頸內(nèi)動脈移植EPCs可以明顯上調(diào)tMCAO大鼠缺血局部腦組織VEGF表達。
　　 結論：
　　 1、分離的大鼠骨髓來源單核細胞，經(jīng)過VEGF、bFGF的誘導分化，鑒定符合EPCs特征。
　　 2、EPCs經(jīng)頸

14、內(nèi)動脈移植tMCAO大鼠后，較多定位于缺血局部腦組織毛細血管壁，較少定位于正常側(cè)腦組織毛細血管壁。
　　 3、EPCs移植組與PBS組相比較，隨著移植后時間的延長，皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡數(shù)量逐漸減少，同時缺血局部腦組織VEGF蛋白表達逐漸升高，伴有缺血腦組織Caspase-3蛋白表達逐漸降低。研究結果提示經(jīng)頸內(nèi)動脈移植EPCs對tMCAO大鼠腦組織的神經(jīng)保護作用可能與其通過旁分泌VEGF抑制了Caspase-3表達，從而減少了皮質(zhì)神經(jīng)元