血管內(nèi)皮細(xì)胞功能在高容量血液濾過(guò)防治多器官功能障礙綜合征中的變化及意義.pdf

1、多器官功能障礙綜合征(MODS)是創(chuàng)傷及感染后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其在高危人群中的發(fā)生率約6％～7％，臨床上平均死亡率高達(dá)70％。因此，研究有效防治MODS發(fā)生、發(fā)展的手段成為近年來(lái)創(chuàng)傷外科和危重病學(xué)領(lǐng)域的重大課題。目前普遍認(rèn)同的是MODS是在機(jī)體免疫狀態(tài)失衡的背景下產(chǎn)生，該背景是以全身的炎癥反應(yīng)為基礎(chǔ)的，這種炎癥反應(yīng)既可以表現(xiàn)為過(guò)度的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，也可以表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)受抑制的狀態(tài)，稱為代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)

2、。所以，如何有效改善這種全身的炎癥狀態(tài)，重建機(jī)體的免疫平衡成為防治MODS最有希望的方向。上世紀(jì)80年代，人們?cè)?jīng)試圖通過(guò)抑制某種或一些炎癥因子的活性，從而改變機(jī)體的炎癥水平，但是實(shí)驗(yàn)室和臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均讓人失望。因?yàn)檠装Y反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，僅阻斷其中的一兩條通道不足以影響全身的炎癥狀態(tài)。尋找一種非特異性的、能夠普遍改變血液循環(huán)中炎癥介質(zhì)濃度的治療方法成為人們新的追求目標(biāo)。血液濾過(guò)便因此進(jìn)入學(xué)者們的視野。 自1977年Kr

3、amer等首次提出連續(xù)性動(dòng)靜脈血液濾過(guò)并應(yīng)用于臨床治療重癥急性腎功能衰竭以來(lái)，20多年中，對(duì)連續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)概念的理解發(fā)生了深刻的變化，歷經(jīng)了連續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)、連續(xù)性血液凈化治療(CBP)高容量血液濾過(guò)(HVHF)等概念的發(fā)展。目前大多數(shù)作者認(rèn)為該技術(shù)主要通過(guò)反復(fù)的超濾和吸附作用來(lái)清除MODS患者循環(huán)內(nèi)的高濃度可溶性促炎和抑炎因子(如TNFα，IL-1β，IL-4、IL-10等)，從而削弱血循環(huán)中促炎介質(zhì)和抗

4、炎介質(zhì)兩種物質(zhì)的峰值濃度，降低過(guò)度的炎癥反應(yīng)或免疫抑制狀態(tài)，重新建立機(jī)體的免疫平衡。 血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)裱襯于整個(gè)心血管系統(tǒng)表面，為單層扁平鱗狀細(xì)胞，現(xiàn)已證明血管內(nèi)皮是機(jī)體內(nèi)最大的器官，能夠合成并分泌多種活性因子，對(duì)血液和血管活動(dòng)的穩(wěn)態(tài)平衡有重要調(diào)節(jié)作用。其功能包括：物理和滲透性屏障功能，承擔(dān)物質(zhì)交換和主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)功能；合成抗凝、致栓物質(zhì)，維持血液動(dòng)態(tài)平衡；合成調(diào)節(jié)血管張力的因子；表達(dá)細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)血管免疫與炎癥反應(yīng)

5、，影響白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與浸潤(rùn)等等。血管內(nèi)皮細(xì)胞與免疫系統(tǒng)的功能異常同被視為SIRS、膿毒癥和MODS等重癥發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，且兩者功能改變密不可分。血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)細(xì)胞黏附分子和內(nèi)皮素-1(ET-1)等黏附和活化免疫細(xì)胞，而免疫細(xì)胞分泌的許多炎癥介質(zhì)，如TNFα、IL-1β等需激活或損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞才能起作用。因此，通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能及其相關(guān)因素，已成為MODS治療的一個(gè)新途徑。目前HVHF防治MODS效果已經(jīng)確認(rèn)，在臨

6、床工作中也已有所開(kāi)展，但是具體理論基礎(chǔ)和使用方法上尚存在爭(zhēng)議。尤其是通過(guò)構(gòu)建大動(dòng)物模型，從血管內(nèi)皮細(xì)胞功能角度多時(shí)相動(dòng)態(tài)了解HVHF如何發(fā)揮防治MODS的機(jī)制研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。 本研究通過(guò)復(fù)制豬MODS模型，予以HVHF干預(yù)，研究其對(duì)MODS的防治作用；同時(shí)觀察此過(guò)程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能變化。實(shí)驗(yàn)分三部分：第一部分目的：利用“二次打擊”法構(gòu)建豬MODS模型。方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為失血性休克+復(fù)蘇再灌注+內(nèi)毒素組(M組，n=9)

7、；對(duì)照組(C組，n=9)，行假手術(shù)，不予以打擊。通過(guò)股動(dòng)脈放血致平均動(dòng)脈壓50±5mmHg，維持1.5-2h，然后回輸60％所失血液和兩倍平衡液復(fù)蘇，12h后由靜脈持續(xù)滴入內(nèi)毒素(1.5mg/kg)，24小時(shí)滴完。連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)心肺肝腎功能。七天后處死存活動(dòng)物。觀察主要器官病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：M組外周血ALT、AST、Cr、BUN均明顯升高，動(dòng)物死亡前顯著高于正常值，PaO2明顯下降；病理學(xué)改變主要以非特異炎癥改變?yōu)橹鳌組各器官的衰竭

8、率：肺77.8％，胃腸道66.7％，肝55.6％，腎33.3％，心22.2％，MODS發(fā)生率達(dá)88.9％，死亡率達(dá)77.8％，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論：利用二次打擊方法，可以成功復(fù)制出動(dòng)物MODS模型，且模型MODS發(fā)生率及死亡率高，重復(fù)性好，病理特征與臨床典型的雙相遲發(fā)MODS相似。 第二部分目的：研究HVHF對(duì)主要臟器功能及MODS發(fā)生率、死亡率的影響。方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分為2組：(1).模型組(M組)9頭，實(shí)

9、施失血性休克+內(nèi)毒素復(fù)合因素打擊，不實(shí)施干預(yù)措施；(2).治療組(HF組)9頭，實(shí)施失血性休克+內(nèi)毒素復(fù)合因素打擊+血液濾過(guò)。在內(nèi)毒素注射完畢后1h，立即給予高容量血液濾過(guò)(超濾量3000ml/hr)治療，持續(xù)時(shí)間為每天12h，共3天。連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)重要臟器功能變化，觀察主要器官病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：(1).早期HVHF干預(yù)，可以明顯改善動(dòng)物模型的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)和肺、肝、腎等重要臟器功能。(2).HF組動(dòng)物各器官功能障礙發(fā)生率分別肺33.

10、3％，胃腸道33.3％，肝33.3％，腎0％，心臟22.2％，其中兩組動(dòng)物的肺、胃腸、腎的發(fā)生率均有顯著差異(P＜0.05)；HF組動(dòng)物MODS發(fā)生率達(dá)為33.3％，M組為88.9％，兩組比較差異顯著(P＜0.01)；(3)HF組動(dòng)物死亡率為22.2％，M組為77.8％，兩組比較差異顯著(P＜0.01)。結(jié)論：高容量血液濾過(guò)能有效控制炎癥反應(yīng)，從而明顯改善各主要臟器功能，降低MODS的發(fā)生率和死亡率。 第三部分目的：觀察血管內(nèi)皮

11、細(xì)胞在HVHF防治MODS中的變化及意義。方法：在不同時(shí)間點(diǎn)分別從M組和HF組動(dòng)物外周血中分離血清，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清中TNFa、IL-1β、IL-10等炎性細(xì)胞因子、TXB2、6-keto-PGF1α等血管活性因子以及sE-selectin、sICAM-1等可溶性細(xì)胞黏附分子的濃度變化。體外培養(yǎng)正常豬髂動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(PIEC)，將M組和HF組不同時(shí)間點(diǎn)的血清經(jīng)處理后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察血清對(duì)PIEC凋亡的影

12、響。分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組PIEC凋亡率，RT-PCR法檢測(cè)各組PIEC中caspase-3的mRNA表達(dá)量，Westernblot技術(shù)檢測(cè)各組PIEC中bcl-2的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：(1).HF組動(dòng)物血清中TNFa、IL-1β、IL-10等炎性細(xì)胞因子濃度與M組相比在相同時(shí)間點(diǎn)均有顯著下降，而IL-10/TNFa較M組有明顯升高(P＜0.05)；(2).HF組血清中TXB2濃度在HVHF干預(yù)后較M組同一時(shí)間點(diǎn)有明顯下降，而6-k

13、eto-PGF1α有明顯升高(P＜0.01)；(3).HF組血清中sE-selectin、sICAM-1濃度分別在HF開(kāi)始后24h及48h后較M組同一時(shí)間點(diǎn)有顯著下降(P＜0.01)、(P＜0.05)；(4).兩組血液濾過(guò)開(kāi)始前血清與自身放血前血清比較，均使PIEC凋亡率、caspase-3mRNA表達(dá)量明顯增加，bcl-2表達(dá)量明顯減少(P＜0.01)；HF組濾過(guò)后24h、48h、72h及處死前血清與濾前血清比較，使PIEC凋亡率、c

14、aspase-3mRNA表達(dá)量明顯降低，bcl-2表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)；與M組同一時(shí)間點(diǎn)比較，差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論：HVHF能有效降低循環(huán)中的炎性細(xì)胞因子水平，使得抗炎和促炎兩方面趨于動(dòng)態(tài)平衡。由于HVHF對(duì)炎癥水平的調(diào)整，可導(dǎo)致VEC分泌PGI2等血管舒張因子增加，從而改善血管張力，降低血栓形成可能，其次，HVHF能減少E-selectin等細(xì)胞黏附分子的合成，減輕炎癥反應(yīng)，再者，HVHF能抑制VEC的過(guò)度凋亡?？?/p>

15、體而言，HVHF能有效改善VEC的功能，防止MODS的發(fā)生、發(fā)展。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)“二次打擊”方法成功構(gòu)建豬MODS模型，并施與HVHF干預(yù)，證實(shí)HVHF能夠有效機(jī)體改善血液動(dòng)力學(xué)狀態(tài)和各個(gè)主要臟器功能，清除過(guò)度釋放的炎性因子，重新建立免疫平衡。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)以血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究靶點(diǎn)，從血管活性因子分泌及抗/促血功能、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)以及VEC凋亡等幾個(gè)方面觀察到HVHF可以改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，減少M(fèi)ODS的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)由VEC功