KZNF家族分子ZNF496功能與機(jī)制的研究.pdf

1、鋅指蛋白496(ZNF496)是哺乳動(dòng)物中最大的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族KZNF家族成員之一。 ZNF496基因轉(zhuǎn)錄的cDNA全長(zhǎng)2453 bp，ORF全長(zhǎng)1764 bp，表達(dá)588aa的蛋白質(zhì)，分別包括SCAN、KRAB、C2H2型鋅指（C2H2-ZFs）三個(gè)結(jié)構(gòu)域及鋅指結(jié)構(gòu)域前的一個(gè)C2HR模體(motif)。ZNF496啟動(dòng)子上的單核甘酸多態(tài)性(SNP)與乳蛋白有顯著的連鎖不平衡(LD)，反芻動(dòng)物ZNF496變體與奶牛乳成分及繁殖率

2、的數(shù)量性狀基因座(QTL)相關(guān);ZNF496是NSD1組蛋白賴氨酸轉(zhuǎn)甲基酶的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而NSD1與兒童急性粒細(xì)胞白血病等疾病相關(guān);ZNF496還充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子，它與jumonji(JMJ)/Jarid2有相互作用，抑制JMJ的的轉(zhuǎn)錄抑制，而JMJ在胚胎發(fā)育上起著重要作用，Jarid2/PRC2還會(huì)增強(qiáng)組蛋白和DNA綁定從而促進(jìn)干細(xì)胞發(fā)育。種種跡象表明，ZNF496在奶牛經(jīng)濟(jì)性狀遺傳、腫瘤調(diào)控、胚胎發(fā)育中起著一定作用。但至今為止，尚

3、無(wú)對(duì)ZNF496的功能和機(jī)制的系統(tǒng)研究。本研究通過(guò)篩選與ZNF496可能存在的相互作用蛋白，并就可能的相互作用蛋白開(kāi)展深入研究，從而探討ZNF496的功能和機(jī)制，為最終揭示它的生理機(jī)制做準(zhǔn)備。
　　分別以ZNF496基因四個(gè)結(jié)構(gòu)域的開(kāi)放閱讀框?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增后連接到酵母表達(dá)質(zhì)粒pDBleu，獲得pDBleu-ZNF496的截短體作為誘餌質(zhì)粒，與人胎肝cDNA文庫(kù)同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選，挑

4、選陽(yáng)性克隆，并轉(zhuǎn)化入含有誘餌質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌中進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，分離陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，利用Blast程序，分析位于閱讀框內(nèi)的獵物蛋白的序列。在得到的10種候選相互作用蛋白中，重點(diǎn)選擇ESRRA、OTUD4、RELA進(jìn)行進(jìn)一步研究。ESRRA是雌激素受體相關(guān)受體，OTUD4是去泛素化酶而RELA是NF-κB信號(hào)通路的重要因子。在HEK293T(人胚腎293T)細(xì)胞中，用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了ZNF496與這些因子的相互作用，利用

5、ZNF496的截短體獲得分別與之相互作用的區(qū)域，用雙熒光素酶報(bào)告基因研究ZNF496對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響，用Western Blot驗(yàn)證了去泛素化酶OTUD4對(duì)ZNF496的調(diào)控。
　　此外，作為與NSD1的協(xié)同抑制因子，NSD1能夠與核受體相互作用，進(jìn)一步探討了ZNF496與雌激素受體α(ERα)的相互作用，用激光共聚焦顯微鏡觀察了ZNF496和ERα在細(xì)胞中的定位;用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了ZNF496與ERα的相互作用;

6、通過(guò)截短體的構(gòu)建，確定了兩者相互作用的區(qū)域;用報(bào)告基因的方法檢測(cè)了ZNF496對(duì)ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　最后為了探討ZNF496的生理功能，構(gòu)建了ZNF496過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，包裝HEK293T細(xì)胞，收集慢病毒，感染MCF-7細(xì)胞，篩選鑒定ZNF496的過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)ZNF496抑制癌細(xì)胞增殖。
　　試驗(yàn)結(jié)果:1.獲取了10種可能與ZNF496存在相互作用的候選蛋白，分別是人骨肉瘤增強(qiáng)9/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凝集素(OS9)

7、，人禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒Vrel生癌的同系物（RELA），人雌激素受體相關(guān)受體α（ESRRA），人C1q和腫瘤壞疽因子相關(guān)蛋白1（C1QTNF1），卵巢腫瘤去泛素化酶4（OTUD4），人纖維裂解蛋白1(FN1)，人TGF-β激活酶1/MAP3K7結(jié)合蛋白2(TAB2)，人核糖體L24結(jié)構(gòu)域包含1(RSL24D1)人補(bǔ)充因子H(CFH)，人ADAMTS樣2（ADAMTSL2）。2.證實(shí)了ZNF496能夠與ESRRA，OS9，C1QTNF1

8、存在相互作用，ZNF496的C2H2-ZFs介導(dǎo)與ESRRA的相互作用。3.ZNF496的C2HR結(jié)構(gòu)域能夠與RELA相互作用。4.在TNFα，1L-β刺激下，過(guò)表達(dá)的ZNF496能夠降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。5.ZNF496與ERα共定位于細(xì)胞核，ZNF496的C2H2-ZFs與ERα的DBD結(jié)構(gòu)介導(dǎo)了兩者的相互作用。6.過(guò)表達(dá)的ZNF496能夠降低ERα的轉(zhuǎn)錄活性，在E2存在情況下ERα的轉(zhuǎn)錄活性。7.過(guò)表達(dá)ZNF496抑制了腫瘤細(xì)

9、胞MCF-7的增殖。
　　結(jié)論:1.得到了10種與ZNF496可能存在相互作用的候選蛋白，并對(duì)其中的部分相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　2.ZNF496能夠抑制激活的NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄活性。
　　3.ZNF496蛋白水平受泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)，OTUD4可能為ZNF496的去泛素化酶。
　　4.ZNF496與ERα存在相互作用，并能抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性。
　　5.ZNF496的過(guò)表達(dá)能夠抑制MCF-7細(xì)胞的