桃ATP-ADP PpIPT基因鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、ATP/ADP異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ATP/ADP IPT)是植物細(xì)胞分裂素從頭合成的關(guān)鍵酶。本試驗(yàn)以桃（Prunus persica）為試材，利用已經(jīng)公布的桃全基因組數(shù)據(jù)，鑒定了桃樹ATP/ADP PpIPT基因家族的4個(gè)成員。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，驗(yàn)證了各ATP/ADPPpIPTs基因在細(xì)胞分裂素合成及調(diào)控植物生長發(fā)育中的功能。利用熒光定量技術(shù)，全面分析了桃樹根、葉及果實(shí)中ATP/ADP PpIPTs基因?qū)ν庠床煌盘?hào)和激素信號(hào)的響應(yīng)特性。分

2、析了桃樹枝條頂端優(yōu)勢過程中，ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)特性以及生長素、細(xì)胞分裂素和獨(dú)腳金內(nèi)酯間的相互作用。檢測了魯星油桃果實(shí)生長發(fā)育全過程中，果實(shí)果肉和種子內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量及ATP/ADP PpIPTs基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化。主要研究結(jié)果如下:
　　1.桃ATP/ADP PpIPTs基因家族成員鑒定及其功能驗(yàn)證
　　GDR預(yù)測的桃ATP/ADP PpIPT基因家族共有5個(gè)成員，通過驗(yàn)證，在桃樹中實(shí)際表達(dá)的是4個(gè)基

3、因，分別命名為PpIPT1、PpIPT3、PpIPT5a和PpIPT5b，各成員均無內(nèi)含子，N端均具有保守結(jié)構(gòu)域序列。生物信息學(xué)分析軟件分析結(jié)果顯示:各成員啟動(dòng)子區(qū)域都含有大量的順式作用元件，反映其表達(dá)可能響應(yīng)植物體內(nèi)外的多種信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞分裂素合成。各成員的亞細(xì)胞定位和組織表達(dá)特性呈現(xiàn)明顯的多樣性，說明它們分別參與了不同的生長發(fā)育調(diào)控過程。過量表達(dá)ATP/ADP PpIPTs的轉(zhuǎn)基因擬南芥的細(xì)胞分裂素含量明顯高于野生型，其生長發(fā)育和抗

4、鹽能力也明顯與野生型不同;各成員過量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因擬南芥呈現(xiàn)相似的表型。以過量表達(dá)pIPT5a的擬南芥為例，與野生型擬南芥相比，其葉片數(shù)量和葉綠素含量顯著高于野生型，主根發(fā)育明顯強(qiáng)于野生型;高鹽脅迫下，過量表達(dá)PpIPT5a的擬南芥的生長明顯比野生型好，顯著提高了其抗鹽能力。
　　2.桃果實(shí)生長發(fā)育過程中果肉和種子細(xì)胞分裂素和ATP/ADP PpIPTs基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　果肉中ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)量在

5、花后兩周內(nèi)迅速下降，之后一直維持在很低的水平，而此時(shí)果肉中細(xì)胞分裂素含量很高，說明果實(shí)發(fā)育前期果肉細(xì)胞分裂所需要的細(xì)胞分裂素可能并不完全來源于自身合成。種子中PpIPT1、3、5b的表達(dá)水平在花后也很低，而PpIPT5a的表達(dá)量在花后兩周迅速升高，這與細(xì)胞分裂素含量在幼果期迅速升高的趨勢相一致，同時(shí)PpIPT5a在種子中的表達(dá)量明顯高于其他部位，因此pIPT5a是果實(shí)前期自身合成細(xì)胞分裂素的關(guān)鍵基因。外源細(xì)胞分裂素處理后，細(xì)胞分裂素的三

6、個(gè)受體中PpHK3和PpHK4的表達(dá)量明顯升高，是果實(shí)細(xì)胞分裂素信號(hào)傳遞的關(guān)鍵受體。桃果實(shí)生長發(fā)育過程中，果肉和種子中細(xì)胞分裂素含量的變化規(guī)律顯示:tZ和iP型細(xì)胞分裂素含量在第一次快速生長期出現(xiàn)最大高峰，而在第二次快速生長期一直保持較低水平，說明細(xì)胞分裂素主要在果實(shí)的第一次快速生長期促進(jìn)細(xì)胞分裂。我們還發(fā)現(xiàn)在硬核期果肉中tZ出現(xiàn)了第二個(gè)高峰，同時(shí)硬核前期外源tZ處理能夠顯著提高內(nèi)果皮POD酶的活性，有利于木質(zhì)素單體聚合形成木質(zhì)素。

7、r>　　3.桃樹氮代謝與細(xì)胞分裂素的互作
　　外源供應(yīng)無機(jī)氮，桃樹能夠快速響應(yīng)硝酸鹽信號(hào)，ATP/ADP PpIPTs基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞分裂素合成增加。其中PpIPT3基因是桃樹中快速響應(yīng)硝酸鹽信號(hào)的關(guān)鍵基因，能夠在外源硝酸鹽處理后2小時(shí)內(nèi)表達(dá)量迅速上升。不同的氮代謝抑制劑預(yù)處理并不能夠抑制PpIPT3基因?qū)ν庠聪跛猁}處理的響應(yīng)，說明進(jìn)入細(xì)胞的硝酸根離子是誘導(dǎo)PpIPT3基因表達(dá)迅速上升的直接信號(hào)分子。外源細(xì)胞分裂素處理對根和枝條

8、內(nèi)氮代謝有重要影響，在根中，外源細(xì)胞分裂素處理能夠抑制根系吸收硝酸根離子，促進(jìn)根內(nèi)硝酸根離子的同化和外運(yùn)。外源細(xì)胞分裂素處理能夠影響葉片中氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)，不同部位不同葉齡葉片內(nèi)氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的受調(diào)控情況不同。N同位素標(biāo)記顯示，外源細(xì)胞分裂素處理能夠促進(jìn)葉片吸收葉施氮素，并促進(jìn)N素向枝條的生物學(xué)下端分配。
　　4.桃樹不同部位ATP/ADP PpIPTs基因?qū)ν庠床煌に靥幚淼捻憫?yīng)特性
　　ATP/ADP PpIPT

9、s基因?qū)に靥幚眄憫?yīng)呈現(xiàn)顯著器官差異。外源細(xì)胞分裂素處理能夠顯著抑制根和葉片中ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)，各成員在根和葉片中對外源細(xì)胞分裂素處理響應(yīng)敏感程度不同。與根和葉片中不同，外源細(xì)胞分裂素處理并不能夠抑制果實(shí)中ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)，相反，外源細(xì)胞分裂素處理還能夠不同程度的誘導(dǎo)果肉和種子中ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)。說明在桃樹根和葉片中存在ATP/ADP PpIPTs基因介導(dǎo)的細(xì)胞分裂素合成

10、的自身反饋抑制調(diào)節(jié)，而桃果實(shí)中沒有。桃樹中ATP/ADPPpIPTs基因?qū)τ谕庠雌渌参锛に靥幚硪渤尸F(xiàn)出顯著地器官差異。
　　5.桃樹枝條頂端優(yōu)勢中ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)特性及激素調(diào)控
　　新梢摘心后，枝條側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPTs基因（PpIPT1、PpIPT3和PpIPT5a）的表達(dá)量迅速上升，與摘心后側(cè)芽部位節(jié)和側(cè)芽內(nèi)細(xì)胞分裂素含量的上升相一致。摘心后側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPT

11、s基因表達(dá)上升引起側(cè)芽部位細(xì)胞分裂素含量的升高對于促進(jìn)側(cè)芽生長是必須的。生長素能夠直接抑制側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPTs基因的表達(dá)，抑制側(cè)芽的生長。與生長素不同，摘心后獨(dú)腳金內(nèi)酯處理沒有抑制側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)ATP/ADP PpIPTs基因表達(dá)的上升，但是會(huì)降低其上升速度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)腳金內(nèi)酯不能夠單獨(dú)抑制側(cè)芽的生長，其發(fā)揮作用依賴于生長素的存在。獨(dú)腳金內(nèi)酯能夠通過控制側(cè)芽部位節(jié)內(nèi)PpPIN1基因的表達(dá)，控制桃樹枝條內(nèi)生長素的極