脂質(zhì)微泡—雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物的制備及其體外生物性能評(píng)價(jià).pdf

1、目的：超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)技術(shù)是一種較具應(yīng)用前景的的靶向給藥方法，通過(guò)在特定部位發(fā)射不同聲強(qiáng)的超聲波，致微泡在超聲作用下破裂，產(chǎn)生空化效應(yīng)及微聲流、微射流、聲化學(xué)、沖擊波等反應(yīng)，使細(xì)胞間隙增寬，膜通透性增加，細(xì)胞表面一過(guò)性小孔形成（聲孔效應(yīng)），從而促進(jìn)藥物通過(guò)血管內(nèi)皮屏障到達(dá)特定部位，提高藥物攝取。UTMD能靶向傳輸抗癌藥物，提高腫瘤局部藥物

2、濃度。該技術(shù)以微泡作為藥物載體，微泡的中心包裹氣體，實(shí)際應(yīng)用中由于氣體的存在藥物包載量不夠高，且流體環(huán)境下微泡性能不穩(wěn)定，半衰期短。紫杉醇(paclitaxel，P)是抗癌藥物中應(yīng)用最廣泛的藥物之一，能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合及組裝，抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。但它用于治療時(shí)的毒副作用大，主要表現(xiàn)為對(duì)骨髓的抑制，對(duì)腎臟、心臟及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。紫杉醇水溶性差，為化學(xué)脂溶性，臨床應(yīng)用時(shí)需以聚氧乙烯蓖麻油和酒精助溶，不

3、僅有全身毒副作用，還易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。生物大分子具有良好的生物相容性及可降解性，在腫瘤組織具有提高滲透和滯留作用的特點(diǎn)(enhanced permeability and retention effect，EPR效應(yīng))，其載藥量大、緩釋性好、性能穩(wěn)定，是一種較理想的增溶脂溶性抗癌藥物的載體。本課題選用具有良好水溶性、生物相容性、生物降解性、非免疫原性、無(wú)毒的天然生物大分子肝素作為藥物載體，通過(guò)功能化修飾改善其兩親性質(zhì)，物理包裹疏水性抗癌藥

4、物紫杉醇，水溶性條件下自組裝形成載紫杉醇聚合物納米粒，從而提高藥物水溶性、降低原藥毒副作用并進(jìn)一步提高藥物生物利用度。盡管納米粒作為藥物載體具有諸多優(yōu)勢(shì)，但由于其粒徑小，易于在靶器官/靶組織以外的器官/組織蓄積，不僅可能導(dǎo)致毒性作用，更降低了藥物在靶器官/靶組織局部的作用濃度?；趦煞N體系的優(yōu)勢(shì)與不足，我們擬通過(guò)生物素-親和素橋連作用將脂質(zhì)超聲造影劑與載紫杉醇聚合物納米粒偶連，借助微泡爆破產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，構(gòu)建一種超聲實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)下實(shí)現(xiàn)藥物

5、定向釋放的新型載藥系統(tǒng)。內(nèi)皮屏障和細(xì)胞膜是基因和藥物到達(dá)病變組織時(shí)遇到的主要屏障，腫瘤組織中缺乏淋巴引流導(dǎo)致間質(zhì)壓力增高進(jìn)一步阻止藥物到達(dá)腫瘤中心，這是目前腫瘤藥物化療中普遍面臨的難題。UTMD導(dǎo)致的聲孔效應(yīng)能夠增加內(nèi)皮間隙和胞膜通透性，同時(shí)具有增效化療藥物的作用，但藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)仍是隨機(jī)的，如何引導(dǎo)藥物主動(dòng)跨越“內(nèi)膜屏障”進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)濃聚而不僅僅是彌散在細(xì)胞周?chē)蚰け砻?，提高藥物有效濃度，是亟待解決的問(wèn)題。細(xì)胞穿膜肽(cell-pen

6、etrating peptides，CPPs)是一大類(lèi)由10～30個(gè)氨基酸組成、可以攜帶多種分子主動(dòng)穿越各種生物膜屏障包括血腦屏障，導(dǎo)入近乎所有細(xì)胞的短肽。自穿膜肽發(fā)現(xiàn)以來(lái)人們利用穿膜肽的轉(zhuǎn)運(yùn)功能已將蛋白質(zhì)、抗體、核酸、脂質(zhì)體、顯像劑、細(xì)胞毒性藥物等多類(lèi)物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞，為許多疾病分子水平的診斷、治療提供了有效手段，但普通穿膜肽缺乏靶向性制約了其進(jìn)一步在體應(yīng)用。葉酸(folic acid, FA)是天然存在的小分子物質(zhì)，幾乎無(wú)免疫原性，葉酸

7、受體(folate receptor, FR)在包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等在內(nèi)的大部分惡性腫瘤組織中高度表達(dá)，而在正常組織中幾乎不表達(dá)。為此，我們將穿膜肽的主動(dòng)穿膜作用與葉酸的腫瘤細(xì)胞靶向性結(jié)合，碳二亞胺法制備攜葉酸、穿膜肽雙配體的載紫杉醇納米粒，之后通過(guò)生物素-親和素橋?qū)⑽⑴菖c雙配體紫杉醇納米粒偶聯(lián)，進(jìn)一步制備多功能微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物，借助葉酸的腫瘤靶向性、穿膜肽的穿膜作用及超聲介導(dǎo)下的多種生物學(xué)效應(yīng)促進(jìn)載藥納米粒主

8、動(dòng)克服生物學(xué)屏障，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效藥物攝取，以期構(gòu)建一種新型的具有高效藥物靶向傳輸能力的載藥系統(tǒng)。
　　 方法：⑴按摩爾比稱(chēng)取一定量的DSPC、DPPE-Biot于三頸瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加25 mL蒸餾水，于70℃水浴攪拌30min，放冷至室溫。把制好的脂質(zhì)混懸液加入50 mL聚丙烯管內(nèi)，將剪切刀頭插至液面下，通入全氟丙烷氣體2 min，以一定的剪切速度剪切一定時(shí)間，制得包裹全氟

9、丙烷氣體的脂質(zhì)微泡，分裝于西林瓶中充入全氟丙烷氣體密閉，制備得到生物素化DiI紅色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡。庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀進(jìn)行粒度分析，激光共聚焦顯微鏡下觀察微泡形態(tài)、熒光分布情況。⑵取一定量的肝素鈉室溫下溶于去離子水中，加入到H+型的交換樹(shù)脂中進(jìn)行離子交換后，加入一定量四丁基氫氧化銨溶液中和，凍干后得到四丁基化肝素。按摩爾比取一定量的四丁基化肝素、丁二酸酐以及催化劑量的DMAP冰浴條件下加入到DMF溶液中，待反應(yīng)物完全溶解后加入一定摩爾量的三

10、乙胺，室溫反應(yīng)，過(guò)夜。反應(yīng)畢將反應(yīng)液透析后，進(jìn)行離子交換，凍干后，得到黃色粉末即為羧基化的肝素。⑶按摩爾比稱(chēng)取一定量的D-生物素、NHS加入到70℃的DMF溶液中，待反應(yīng)物完全溶解后，將反應(yīng)液冷卻至室溫;加入催化劑量的DCC，室溫反應(yīng)過(guò)夜后，過(guò)濾，收集上清液。將上清液加入到含有一定量的三乙胺、乙二胺的5mLDMF溶液中，反應(yīng)約3～4h。反應(yīng)液中加入過(guò)量乙醚，過(guò)濾，得到白色不溶物，即為氨基化的生物素。⑷稱(chēng)取一定量的葉酸以及催化劑量的DCC

11、、NHS加入到25 mL的DMSO溶液中，50℃下避光反應(yīng)5～6h，過(guò)濾，收集上清液。按摩爾比取一定量的三乙胺、乙二胺加入到上清液中，室溫，避光反應(yīng)，過(guò)夜。反應(yīng)畢將反應(yīng)液滴加進(jìn)過(guò)量乙腈，收集沉淀物。將沉淀物溶于去離子水中，調(diào)節(jié)溶液呈酸性，過(guò)濾。用無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚反復(fù)洗滌沉淀物，得到黃色粉末狀固體，即為氨基化的葉酸。⑸按摩爾比稱(chēng)取一定量的羧基化肝素、氨基化生物素、氨基化葉酸、Tat肽以及催化劑量的EDC·HCl、NHS，并加入Orego

12、n green染料，室溫下避光反應(yīng)、過(guò)夜。雙配體載體制備完后，室溫下加入一定量紫杉醇攪拌30 min后，反應(yīng)液透析48 h后，得到生物素化攜葉酸、穿膜肽雙配體的Oregon green綠色熒光標(biāo)記的紫杉醇納米粒。核磁共振氫譜法測(cè)定其結(jié)構(gòu)，動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定其粒徑及電位，透射電鏡觀察其形態(tài)，紫外光譜方法測(cè)定其載藥量。⑹取一定量的生物素化DiI紅色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡，加入鏈親和素，洗滌純化后加入生物素化雙配體紫杉醇納米粒，冰上孵育30 min

13、，洗滌純化后即制備出脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物。庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀進(jìn)行粒度分析。激光共聚焦顯微鏡下觀察生物素化DiI紅色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡與Oregon green綠色熒光標(biāo)記的雙配體紫杉醇納米粒的連接情況。用1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL的雙配體紫杉醇納米粒與脂質(zhì)微泡結(jié)合形成脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物，低速離心去除未與微泡結(jié)合的雙配體紫杉醇納米粒，計(jì)算雙配體紫杉醇納米粒與微泡的結(jié)合率，求得脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米

14、粒復(fù)合物的載藥量。⑺用脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物孵育葉酸受體陽(yáng)性表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及葉酸受體陰性表達(dá)的人肺癌細(xì)胞A549，加入脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物后立即輔以不同的輻照聲強(qiáng)及輻照時(shí)間（即1.0 W/cma2，40 s;1.5 W/cm2，20 s;1.5 W/cm2，40 s;1.5 W/cm2，60 s），4h后Hochest33342染色細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察不同條件輻照組Oregon gr

15、een綠色熒光標(biāo)記的雙配體紫杉醇納米粒在兩種細(xì)胞內(nèi)的的分布情況。⑻為評(píng)估葉酸和Tat的作用，分別以葉酸紫杉醇納米粒，Tat紫杉醇納米粒，雙配體紫杉醇納米粒孵育MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞4h后，流式細(xì)胞分析儀定量分析兩種細(xì)胞紫杉醇納米粒的攝取情況。⑼分別用雙配體紫杉醇納米粒，脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照，脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物無(wú)超聲輻照作用于MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞，孵育4h后，Ho

16、chest33342染核后，激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細(xì)胞各組的細(xì)胞核周?chē)昂藘?nèi)的紫杉醇納米粒分布情況。⑽采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞在(1)空白微泡聯(lián)合超聲輻照，(2)小分子紫杉醇，(3)雙配體紫杉醇納米粒，(4)脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照條件下的細(xì)胞相對(duì)存活率的比較均采用One-Way ANOVA，方差不齊則選用近似F檢驗(yàn)Welc

17、h法進(jìn)行方差分析，差異性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為p＜0.05（雙側(cè)）。
　　 結(jié)果：①脂質(zhì)微泡的理化性質(zhì):制備得到的脂質(zhì)體微泡(MBs)在激光共聚焦顯微鏡下觀察分布均勻，無(wú)聚集現(xiàn)象，單個(gè)微泡外觀圓整。庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得MBs濃度約為(11.31±1.0)×108個(gè)/mL，粒徑為(2.20±0.93)μm。激光共聚焦顯微鏡下見(jiàn)DiI標(biāo)記的脂質(zhì)微泡(DiI-MBs)外殼發(fā)出明亮的紅色熒光，表明DiI標(biāo)記的脂質(zhì)微泡制備成功。②高效液相色譜及質(zhì)譜分析

18、:合成肽Tat高效液相色譜分析主峰測(cè)定值為1559.86 Da，與理論分子量1560 Da基本相符，主峰含量約97.8％，合成成功。③雙配體紫杉醇納米粒的理化性質(zhì):動(dòng)態(tài)光散射儀顯示雙配體紫杉醇納米粒的粒徑約為120-±7 nm，電位約為-35±4 mv。透射電鏡下觀察納米粒呈圓形，無(wú)明顯聚集現(xiàn)象。紫外光譜方法測(cè)定其載藥量約8.84％。④脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物的理化性質(zhì):庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得其濃度約為(7.78±1.2)×108個(gè)

19、/mL，粒徑為(2.26±0.86)μm。激光共聚焦顯微鏡下觀察脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物外殼發(fā)出明亮的黃色熒光，表明Oregongreen綠色熒光標(biāo)記的雙配體紫杉醇納米粒與DiI紅色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡外殼連接成功。雙配體紫杉醇納米粒的濃度為2mg/mL時(shí)，脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物的載藥量最高，即每108個(gè)復(fù)合物載紫杉醇的量為106.7μg。⑤熒光顯微鏡下觀察MDA-MB-231細(xì)胞在輻照聲強(qiáng)為1.0 W/cm2，時(shí)間

20、為40 s的條件下，Hochest33342藍(lán)色熒光染色的細(xì)胞核周?chē)皟?nèi)部見(jiàn)較多Oregon green綠色熒光標(biāo)記的雙配體紫杉醇納米粒。而在其他輻照條件下細(xì)胞核周?chē)皟?nèi)部均見(jiàn)較少綠色熒光。A549細(xì)胞在輻照聲強(qiáng)為1.5W/cm2，時(shí)間為40 s的條件下，Hochest33342藍(lán)色熒光染色的細(xì)胞核周?chē)皟?nèi)部見(jiàn)較多Oregon green綠色熒光標(biāo)記的雙配體紫杉醇納米粒。而在其他輻照條件下細(xì)胞核周?chē)皟?nèi)部均見(jiàn)較少綠色熒光。⑥分別用葉酸紫

21、杉醇納米粒，Tat紫杉醇納米粒，雙配體紫杉醇納米粒孵育MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞4h后，MDA-MB-231細(xì)胞在雙配體紫杉醇納米粒組攝取熒光的量最多，而A549細(xì)胞在雙配體紫杉醇納米粒組和Tat紫杉醇納米粒組攝取熒光的量基本一致。⑦分別用雙配體紫杉醇納米粒，脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照，脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物無(wú)超聲輻照作用于MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞，4h后在同種作用條件下MDA-

22、MB-231細(xì)胞內(nèi)綠色熒光明顯強(qiáng)于A549細(xì)胞，且綠色熒光主要分布在MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。以上兩種細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度在脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照組最強(qiáng)，在脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物無(wú)超聲輻照組最弱。⑧24h后MDA-MB-231細(xì)胞及A549細(xì)胞的相對(duì)存活率依次為空白微泡聯(lián)合超聲輻照組＞小分子紫杉醇組＞雙配體紫杉醇納米粒組＞脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照組(P

23、＜0.05)。對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞，雙配體紫杉醇納米粒和脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照的半數(shù)抑制濃度分別為45.8μg/mL和17.3μg/mL;對(duì)A549細(xì)胞，雙配體紫杉醇納米粒和脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物聯(lián)合超聲輻照的半數(shù)抑制濃度分別為50.3μg/mL和6.1μg/mL。
　　 結(jié)論：⑴成功制備脂質(zhì)微泡-雙配體紫杉醇納米粒復(fù)合物。⑵不同種類(lèi)細(xì)胞對(duì)促進(jìn)藥物攝取的最佳輻照參數(shù)不一樣。MDA-MB-