不同鋅源對豬腸上皮細胞IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運蛋白基因水平的影響.pdf

1、本試驗以豬腸上皮細胞IPEC-1為實驗?zāi)Ｐ?，研究了三種鋅源（甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫酸鋅）對IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運蛋白基因水平的影響。并通過RNA干擾，研究ZIP4在腸道鋅轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮的作用，進一步探討氨基酸螯合鋅在豬腸道的可能吸收模式。試驗分以下兩部分進行:
　　試驗一 不同鋅源和鋅水平對IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的影響
　　1.不同鋅源對豬腸上皮細胞IPEC-1細胞增殖的影響
　　試驗以IPEC-1為研究對

2、象，分別在IPEC-1細胞培養(yǎng)液中添加鋅濃度為0、50、100、150、200μmol/L的三種鋅源（甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫酸鋅）分別培養(yǎng)6h、12h、24 h，MTT法測定細胞增殖變化。結(jié)果表明:在作用6h、12h或24 h后，高劑量的三種鋅源均顯著抑制豬腸上皮細胞的生長（P＜0.05），其中以6h時細胞活性值的下降幅度最小，但高劑量（100μmol/L以上）同濃度的有機鋅對IPEC-1細胞的損傷小于無機鋅。同時甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫

3、酸鋅組IPEC-1細胞活性具有明顯的劑量依賴效應(yīng)，隨著鋅濃度的增加細胞活性下降，并且在鋅添加水平≥100μmnol/L時下降明顯。因此本試驗選擇50μmol/L、6h作為最佳處理濃度和時間用于后期試驗。
　　2.不同鋅源對豬腸上皮細胞IPEC-1鋅吸收轉(zhuǎn)運蛋白基因水平的影響
　　選用鋅濃度為50μmol/L的三種鋅源（甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅、硫酸鋅）或鋅濃度為0、50、100、200μmol/L的甘氨酸鋅分別作用于IPEC-1細

4、胞，處理6h。Real-time PCR法測定MT1、DMT1、ZIP4、ZIP5、ZnT1、ZnT2 mRNA表達水平，以β-actin mRNA水平作為內(nèi)參對照。結(jié)果表明:三種鋅源均可快速有效改善細胞鋅狀態(tài)。添加鋅可顯著上調(diào)IPEC-1細胞MT1、ZIP5、ZnT1和ZnT2 mRNA表達水平（P＜0.05），下調(diào)ZIP4 mRNA表達水平(P＜0.05)，但三種鋅源處理組組間差異顯著。與對照組相比，甘氨酸鋅組能較顯著地上調(diào)MT1、

5、DMT1、ZnT1mRNA表達水平（P＜0.05）;硫酸鋅和蛋氨酸鋅組ZnT2 mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05），DMT1、ZIP4 mRNA表達水平均顯著下降（P＜0.05）;硫酸鋅組ZIP5 mRNA表達水平顯著增加(P＜0.05)，其他各組差異不顯著（P＞0.05）。同時添加不同水平的甘氨酸鋅處理IPEC-1細胞6h后，MT1、ZIP5、ZnT1、ZnT2mRNA表達水平顯著增加(P＜0.05)，ZIP4 mRNA表達水平

6、顯著下降（P＜0.05）。添加鋅濃度為50μmol/L的甘氨酸鋅可顯著增加DMT1 mRNA表達水平（P＜0.05），而高濃度鋅添加量（100、200μmol/L）均顯著降低其表達水平(P＜0.05)。
　　試驗二 ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染對IPEC-1 MT1、DMT1 mRNA表達及細胞鋅吸收率的影響
　　以豬腸上皮細胞IPEC-1為研究對象，設(shè)計合成針對ZIP4基因的siRNA，經(jīng)LipofectamineTM2000

7、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染IPEC-1細胞24 h、48 h，RT-PCR法檢測ZIP4mRNA水平表達的變化，并用MTT法檢測IPEC-1細胞增殖的變化;添加50μmol/L硫酸鋅、甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅分別處理ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染細胞6h，RT-PCR法檢測MT1、DMT1 mRNA表達變化，ICP-MS法檢測IPEC-1細胞鋅吸收率的變化。研究結(jié)果表明:
　　(1)4對ZIP4-siRNA序列轉(zhuǎn)染IPEC-1細胞24 h或48 h可有效抑制

8、ZIP4 mRNA表達，其中ZIP4-siRNA1序列抑制效果更明顯。與空白對照組相比，24 hZIP4-siRNA1抑制率達到64.60％;48 h干擾效果更加突出，抑制率達到78.43％。同時MTT結(jié)果顯示，ZIP4-siRNA1轉(zhuǎn)染IPEC-1細胞24 h或48 h對細胞MTT OD值無顯著影響（P＞0.05）。因此，本試驗選取ZIP4-siRNA1和24 h分別作為最佳特異性RNA干擾序列和干擾時間。
　　(2)不同鋅源作

9、用IPEC-1轉(zhuǎn)染細胞6h發(fā)現(xiàn):添加硫酸鋅和甘氨酸鋅的轉(zhuǎn)染組MT1 mRNA表達水平較陰性對照組分別下降了16.94％(P＜0.05)、33.62％（P＜0.05），但添加蛋氨酸鋅的轉(zhuǎn)染組MT1 mRNA表達水平與陰性對照組差異不顯著（P＞0.05）。與陰性對照組相比，添加硫酸鋅的轉(zhuǎn)染組DMT1 mRNA表達水平提高了29.61％（P＞0.05），而添加甘氨酸鋅和蛋氨酸鋅的轉(zhuǎn)染組DMT1 mRNA表達水平分別下降了29.85％(P＜0.

10、05)、26.44％(P＜0.05)。添加硫酸鋅作用6h后，ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染組IPEC-1細胞鋅吸收率較陰性對照組下降了73.33％（P＜0.05），但ZIP4-siRNA轉(zhuǎn)染前后對甘氨酸鋅和蛋氨酸鋅組細胞鋅吸收率影響不顯著（P＞0.05）。
　　綜上所述，添加甘氨酸鋅、蛋氨酸鋅或硫酸鋅均可快速有效改善細胞鋅狀態(tài);高劑量的三種鋅源均可抑制豬腸上皮細胞增殖，但高劑量（鋅濃度≥100μmol/L）同濃度的有機鋅對豬腸上皮細胞的

11、損傷小于無機鋅;三種鋅源對腸道鋅吸收轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達存在差異，甘氨酸鋅組能夠較顯著地上調(diào)MT1、DMT1、ZnT1mRNA表達水平，硫酸鋅和蛋氨酸鋅組ZnT2 mRNA表達水平顯著增加，DMT1、ZIP4 mRNA表達均顯著下降，硫酸鋅組ZIP5 mRNA表達水平顯著高于其他各組。添加不同水平的甘氨酸鋅可顯著上調(diào)MT1、ZIP5、ZnT1、ZnT2 mRNA表達水平，下調(diào)ZIP4 mRNA表達水平。RNAi實驗進一步證實硫酸鋅在腸道的