植物乳桿菌調節(jié)豬腸上皮細胞屏障功能和轉運載體的研究.pdf

1、本論文旨在研究植物乳桿菌（LP）對感染產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）K88的腸上皮細胞（IPEC-J2）屏障功能、轉運載體表達及免疫反應的影響。試驗分成3個部分：
　　試驗一：
　　1）選取不同濃度ETEC K88（MOI=10、25、50、75和100）攻毒IPEC-J2細胞不同時間（1、2、3和4 h），通過測定細胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達，確定ET

2、EC-K88的最佳攻毒濃度和時間，建立ETEC K88-IPEC-J2互作模型；
　　2）選取不同濃度的LP（MOI=10、25、50、75和100）預處理IPEC-J2細胞不同時間（3、6和9 h）并攻毒，通過測定細胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達，確定LP的最佳處理濃度和時間，建立LP-IPEC-J2互作模型；
　　3）通過測定細胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量，確定LP-IPEC-J2-ET

3、EC K88互作模型。結果表明：
　　1）與對照組相比，ETEC K88（MOI=50）攻毒IPEC-J2細胞3 h后，細胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達顯著上調（P<0.05）；因此，確定ETEC K88與IPEC-J2互作的最佳模型為MOI=50，培養(yǎng)時間3 h；
　　2）與ETEC K88對照組相比，LP（MOI=75）預處理IPEC-J2細胞6 h后，細胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TN

4、F-α的mRNA表達顯著下調（P<0.05）；因此，確定LP與IPEC-J2互作的最佳模型為MOI=75，培養(yǎng)時間為6 h；
　　3）與對照組相比，ETEC K88（MOI=50）攻毒IPEC-J2細胞3 h后，細胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量顯著升高（P<0.05），而與ETEC K88組相比，LP預處理后，細胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量顯著降低（P<0.05）；
　　綜上，我們確定ETEC-IPEC-J

5、2-LP互作模型為：LP（MOI=75，約為1×108CFU）預處理IPEC-J2細胞6 h后，再進行ETEC K88（MOI=50，約為6.5×107CFU）攻毒IPEC-J2細胞3 h。
　　試驗二：將IPEC-J2細胞接種于與Transwell6孔板，細胞分化后（約為1.3×106個/孔），在試驗一確定的互作模型條件下，對細胞進行LP預處理和ETEC K88攻毒，之后收集細胞并保存待測定。試驗中，未做任何處理的細胞定為對照組

6、，單獨做 LP預處理的細胞定為LP組，單獨做ETEC K88攻毒的細胞定為K88組，LP預處理后進行攻毒的細胞定為LP+ K88組，每組共6個重復（孔）。結果表明：
　　1）與對照組相比，ETEC K88攻毒后，IPEC-J2細胞TEER值顯著下降（P<0.05）；細胞中緊密連接claduin-1、occludin、ZO-1的mRNA表達（P<0.05）及claudin-1及occludin的蛋白表達顯著下降（P<0.05）；與K

7、88組相比，LP預處理后能夠顯著抑制ETEC K88誘導的細胞TEER值的下降（P<0.05）、抑制ETEC K88誘導的細胞中claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA表達（P<0.05）及occludin蛋白表達的下降（P<0.05）；激光共聚焦的結果與上述結果一致，表明ETEC K88能夠破壞緊密連接claudin-1及occludin的表達，而LP預處理可以緩解ETEC K88對IPEC-J2細胞緊密連接的破壞。<

8、br>　　2）與對照組相比，ETEC K88攻毒后，IPEC-J2細胞中葡萄糖轉運載體SGLT1、氨基酸轉運載體y+LAT1、CAT1和ASCT2的mRNA表達均顯著下調（P<0.05）、氯離子轉運載體CFTR及NKCC1的mRNA表達均顯著上調（P<0.05）；與K88組相比，LP預處理后能顯著抑制 IPEC-J2細胞中上述葡萄糖及氨基酸轉運載體的mRNA表達的下調（P<0.05）、抑制細胞中上述氯離子轉運載體mRNA表達的上調（P<

9、0.05）；無論是LP預處理還是K88攻毒均對細胞中葡萄糖轉運載體GLUT2、SGLT3及氨基酸轉運載體CAT2、b0,+AT的mRNA表達無顯著影響（P>0.05）。
　　3）與對照組相比，ETEC K88攻毒后，IPEC-J2細胞中促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達顯著上調（P<0.05），而抗炎性細胞因子TGFβ及PPAR-γ的mRNA表達顯著下調（P<0.05）；IPEC-J2細胞中TL

10、R1、TLR2、TLR6、TLR9的mRNA表達及TLR2的蛋白表達顯著下調（P<0.05），而TLR5和TLR7的mRNA表達顯著上調（P<0.05）；細胞中TLR負調控因子SIGIRR、Bcl3和MKP-1的mRNA表達顯著下調（P<0.05）。與K88組相比，LP預處理后，能夠抑制促炎性細胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α的mRNA表達的上調（P<0.05），抑制抗炎性細胞因子TGFβ及PPAR-γ的mRNA表達的下調（P<0

11、.05），抑制ETEC K88誘導的TLR4、TLR5和TLR7的mRNA表達的升高及TLR2mRNA和蛋白表達的降低（P<0.05），抑制ETEC K88誘導的SIGIRR、Bcl3和MKP-1的mRNA表達的下調（P<0.05）。此外，LP單獨預處理細胞后，能夠顯著上調細胞中PPAR-γ、TLR6及Bcl3的mRNA表達（P<0.05）。無論是LP預處理還是K88攻毒處理細胞后，細胞中TLR3、Tollip、A20及IRAK-M的m

12、RNA表達均無顯著變化（P>0.05）。
　　試驗三：將IPEC-J2細胞接種于與Transwell6孔板，細胞分化后（約為1.3×106個/孔），將LP（1×108CFU/well）與細胞于37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6 h后，去除培養(yǎng)上清并用PBS清洗細胞。之后用ETEC K88（MOI=50，約為6.5×107CFU）攻毒細胞。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、12、25和50 min后，去除培養(yǎng)上清，PB

13、S清洗細胞。之后收集細胞并測定P38、p-P38及IκBα的蛋白表達。試驗中單獨做ETEC K88攻毒的細胞定為K88組，LP預處理后進行攻毒的細胞定為LP+ K88組，每組共6個重復（孔）。結果表明：與K88組相比，K88攻毒12、25及50 min后，LP預處理的細胞中IκBα的蛋白表達顯著增加（P<0.05）；K88攻毒25 min和50 min后，LP預處理的細胞中p-P38的蛋白表達顯著降低（P<0.05），即表明LP可以一定