利用短乳桿菌制備γ-氨基丁酸相關(guān)過程研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyfic acid,簡稱為GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸,為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有降血壓、治療癲癇、鎮(zhèn)靜安神、增強(qiáng)記憶、控制哮喘、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖、活化肝腎等多種生理功能,其制備和應(yīng)用廣受人們的關(guān)注與重視. 本文系統(tǒng)地研究TN用短乳桿菌生物法制備GABA的過程及相關(guān)工藝.論文在建立γ-氨基丁酸分析方法的基礎(chǔ)上,從自然界選育得到了一株GABA高產(chǎn)菌株;通過

2、對搖瓶培養(yǎng)條件和發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的優(yōu)化,提高了GABA的發(fā)酵產(chǎn)量;采用游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞對催化合成GABA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.此外,對短乳桿菌細(xì)胞內(nèi)催化合成γ-氨基丁酸唯一的關(guān)鍵限速酶-谷氨酸脫羧酶進(jìn)行了分離純化,并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究. 首先,建立了GABA的定性和定量方法,紙層析和薄層層析法用于GABA定性分析,高效液相色譜法(HPLC)用于GABA定量分析.采用HPLC定量分析GABA時,以丹磺酰氯作柱前衍生劑,

3、樣品的pH高于7.5以及衍生化時間超過20min,衍生化反應(yīng)穩(wěn)定;GABA濃度(C)在0.1～2 mM之間與峰面積(A)線性關(guān)系良好,線性方程為A=313.242·C+8.314,相關(guān)系數(shù)R為0.9997,GABA的加標(biāo)回收率為95.30﹪～106.34﹪. 其次,從未滅菌的新鮮牛奶中篩選到一株產(chǎn)GABA的菌株,記為hjxj-01,發(fā)酵72h后GABA的產(chǎn)量6.9 g/L.根據(jù)菌株Wxj-01的菌落形態(tài)以及生理生化特性,鑒定為短

4、乳桿菌Lactobacillus brews hjxj-01.以Lactobacillus brevis hjxj-01為出發(fā)菌株,經(jīng)UV和<'60>Co γ-射線反復(fù)誘變處理,以含不同濃度的GABA梯度平板進(jìn)行篩選,得到一株高產(chǎn)GABA的突變株Lactobacillus brews hjxj-08119,發(fā)酵72hGABA的產(chǎn)量17g/L,比野生菌株產(chǎn)量提高了140﹪,此高產(chǎn)突變株遺傳性狀穩(wěn)定,傳代12次,菌株未出現(xiàn)回復(fù)突變情況.高產(chǎn)

5、突變株Lactobacillus brevis hjxj-08119已在中國微生物菌種保藏管理委員會(CGMCC)保藏,保藏編號為CGMCCNO.1306. 第三,利用Plackett-Burman設(shè)計對影響Lactobacillus brevis hjxj-08119發(fā)酵生產(chǎn)GABA的15種相關(guān)因素進(jìn)行了效應(yīng)評價,篩選出具有顯著正效應(yīng)的三個因素:葡萄糖、MnSO<,4>-4H<,2>O和L-谷氨酸鈉(L-MSG),其他因素對G

6、ABA產(chǎn)量無顯著影響.然后對具有顯著正效應(yīng)的三個因素進(jìn)行進(jìn)一步考察,確定了三個因素的取值范圍,以Hybrid設(shè)計得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)訓(xùn)練樣本,建立BP(back propagation)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,粒子群(PSO)算法對建立的ANN模型進(jìn)行全局尋優(yōu),得到最佳培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖17.6,酵母膏15,蛋白胨5,乙酸鈉3,MgSO<,4>.7H<,2>O 0.03,MnSO<,4>·4H<,2>O 0.02,

7、NaCl 0.001,FeSO<,4>·7H<,2>O 0.001,L-MSG 73.3,初始pH 6.8,發(fā)酵溫度30℃,250 mL三角瓶中的裝液量為50 mL/250 mL.在此發(fā)酵條件下,GABA的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到33.42 g/L,較突變株Lactobacillus brevisRET基因各位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)等位基因頻率在不同類型間的差異. 4.單倍型與HDRET基因啟動子單倍型-5A/1C占HD組82.5﹪,較對照組差異有顯著

8、性(P<0.05). RET基因四位點(diǎn)(-5,-1,c135,c2307)單倍型ACAG占HD組75.2﹪,較對照組差異有顯著性(P<0.05). 5.不同種族人群之間各等位基因頻率RET基因-5A、c135A和c2307G等位基因頻率明顯高于高加索和非洲人種(P<0.05)6.RET基因啟動子多態(tài)性與RET蛋白表達(dá)關(guān)系RET基因啟動子基因型-5AA/-1CC較其他基因型RET蛋白表達(dá)降低(P<0.05). 啟動

9、子單倍型-5A/1C純合子較-5A/1C雜和子PET蛋白表達(dá)降低(P<0.05). 結(jié)論 1.RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四個位點(diǎn)多態(tài)性與浙江漢族人群HD明顯相關(guān),但與HD類型無明顯相關(guān). 2.RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四個位點(diǎn)單倍型ACAG是浙江漢族人群的HD相關(guān)核心單倍型. 3.浙江漢族人群的RET基因-5、c135和c23