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文檔簡介
1、目的:優(yōu)化建立最佳板藍根脂質體制備工藝,運用脂質體沉淀超濾離心的方法,結合HPLC以及LC-ESI-MS技術,篩選出板藍根提取液中能夠被脂質體吸收的成分;并在體外建立模擬胃腸道微環(huán)境,推斷這些成分是否受胃腸道酸堿環(huán)境的影響以及主要的代謝過程,最終確定板藍根中合理的活性成分;研究板藍根中合理的活性成分在 Caco-2細胞模型的吸收、轉運特性及其機制。
方法:(1)采用薄膜分散法,以膽固醇、大豆卵磷脂為載體,通過正交試驗考察了大豆
2、卵磷脂與膽固醇的用量比、水化的時間、水合介質用量和水合介質pH值對制備工藝的影響。以脂質體的包封率為評價指標,以板藍根中的胞苷、腺苷為檢測指標,采用HPLC進行含量測定,最終確定最佳制備工藝。(2)運用最佳的板藍根脂質體的制備工藝,借助HPLC-MS手段,進一步研究能夠被脂質體包裹的、具有生物膜活性的大分子物質。(3)以已在板藍根脂質體中檢測到的精氨酸、胞苷、尿苷、表高依春、腺苷為研究對象,運用沉淀離心-超濾技術,借助HPLC聯合LC-
3、ESI-MS分析比對,在模擬的胃腸道環(huán)境下(pH1.0~8.0),考察這些成分是否受酶的影響、受何種酶的影響、以及是否有代謝產物的產生。最終確定合理的板藍根活性成分。(4)建立 Caco-2細胞攝取、轉運模型,采用MTT法考察受試化合物對Caco-2細胞的安全性,選擇跨膜電阻值、堿性磷酸酶和熒光素鈉通透性3個指標對所建立的模型進行檢驗。考察濃度、時間、溫度、pH值及抑制劑對受試化合物吸收的影響,采用HPLC法檢測受試化合物的濃度,測定受
4、試化合物從AP側→BL側和BL側→AP側轉運量,計算其在不同側的表觀滲透系數(Papp(AP-BL)、Papp(BL-AP))和外排率ER(ER=Papp(BL-AP)/Papp(AP-BL))
結果:(1)確定最佳制備工藝條件為:大豆卵磷脂與膽固醇的比例為6:1,水化時間為25 min,PBS磷酸鹽緩沖溶液的用量為10 mL,水化介質的pH值為6.86。胞苷和腺苷分別在10.27~500.3μg·mL-1(r=0.9998,
5、n=6)和10.36~493.6μg·mL-1(r=0.9997,n=6)范圍內呈線性關系良好;精密度、回收率、穩(wěn)定性均良好。(2)進一步分析研究,最終在板藍根脂質體中檢測到能夠被脂質體包裹的、具有生物膜活性的五種成分:精氨酸、胞苷、尿苷、表高依春、腺苷。(3)通過LC-MS檢測結果可知,板藍根中主要成分的對照品,除了表高依春外,精氨酸、胞苷、腺苷均受人工胃腸道環(huán)境的影響;在模擬不同酸堿度的胃腸道微環(huán)境下,經過HPLC分析結果可知,板藍
6、根藥液中的成分精氨酸、胞苷主要受胃腸道環(huán)境下胰蛋白酶的影響,腺苷主要受胃腸道環(huán)境下胃蛋白酶的影響;最后通過LC-MS技術最終確定,精氨酸受胰蛋白酶的影響,代謝產生了鳥氨酸;腺苷受胃蛋白酶影響,代謝產生了腺嘌呤??梢猿醪酱_定板藍根中的精氨酸、腺苷為活性成分。(4)用于轉運實驗的Caco-2細胞經過21天培養(yǎng)分化后,在形態(tài)上與小腸上皮細胞相似;熒光素通透量小于0.5%/h,跨膜電阻大于200Ω·cm2,細胞產生極性分化,形成均勻的細胞單層,
7、且其致密性、完整性及功能性均良好。Caco-2細胞對板藍根中的成分精氨酸、腺苷的吸收在60 min內呈線性關系,藥物的攝取時間為60 min;隨著溫度的升高,板藍根成分中的精氨酸、腺苷的攝取量均降低;板藍根中的精氨酸成分的攝取量最大,但隨著pH的升高,精氨酸成分的攝取量在降低;而板藍根中的腺苷成分隨pH升高攝取量升高;P-gp抑制劑維拉帕米可顯著增加Caco-2細胞對板藍根中的精氨酸、腺苷的吸收(P<0.05)。精氨酸和腺苷雙向轉運的表
8、觀滲透性良好,外排率ER均大于1.5,且存在方向差異。
結論:本實驗借助于超濾沉淀技術,聯用HPLC、LC-ESI-MS分析手段,初步篩選出板藍根中能夠被脂質體包裹的、具有生物膜活性的五種成分:精氨酸、胞苷、尿苷、表高依春、腺苷;再通過體外模擬胃腸道微環(huán)境的代謝情況和Caco-2細胞轉運模型,最終快速、準確地篩選并鑒定出板藍根成分中的精氨酸、腺苷為合理有效的活性成分。與藥效成分常規(guī)篩選方法相比,超濾質譜技術作為中藥活性成分初篩
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