地塞米松和他克莫司對(duì)HaCaT細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體和熱休克蛋白90表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、背景:糖皮質(zhì)激素(GC，簡(jiǎn)稱激素)外用制劑是治療炎癥性皮膚病的主要藥物，但在治療過(guò)程中易出現(xiàn)激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象。糖皮質(zhì)激素受體(GR)介導(dǎo)了激素作用的發(fā)揮，GRα的表達(dá)水平或與激素的親和力下降將影響患者對(duì)激素治療的敏感性，高水平的GR可能預(yù)示對(duì)激素的抵抗，而較低水平的GRβ可能預(yù)示對(duì)激素的高度敏感或超敏。
　　 熱休克蛋白90(HSP90)是GRα的分子伴侶蛋白，HSP90 水平的改變可能導(dǎo)致其與GR比例失調(diào)并引起對(duì)激素反應(yīng)

2、性的減弱。
　　 激素被發(fā)現(xiàn)可下調(diào)GRα或上調(diào)GRβ的表達(dá)，可能是引起激素“耐受或抵抗”的原因之一，臨床上為了減少或延緩上述現(xiàn)象的發(fā)生，常采用激素與非激素類抗炎劑交替使用的原則，但這種經(jīng)驗(yàn)性用藥沒(méi)有確切的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)支持。他克莫司外用制劑在治療炎癥性皮膚病方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，體外研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司對(duì)激素的作用具有一定的調(diào)節(jié)效應(yīng)，他克莫司的作用機(jī)制可能涉及GR的活化。
　　 激素可下調(diào)GRα表達(dá)或上調(diào)GRβ表達(dá)，因此控制

3、外用激素制劑的使用時(shí)間很重要。
　　 而在激素停止作用后，激素所致表達(dá)水平已經(jīng)發(fā)生改變的GR的后續(xù)變化趨勢(shì)尚不清楚；他克莫司與激素制劑的作用機(jī)制可能存在潛在的相關(guān)性，它們?cè)趩为?dú)作用或與激素配合作用時(shí)對(duì)GR表達(dá)的調(diào)節(jié)也不清楚；皮膚局部炎癥過(guò)程涉及復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，他克莫司在皮膚中的抗炎機(jī)制值得進(jìn)一步研究，此外，HSP90作為GR的分子伴侶蛋白，與GRα的作用機(jī)制密切相關(guān)，因此有必要了解在調(diào)節(jié)GRα表達(dá)的同時(shí)對(duì)HSP90表達(dá)的影響

4、。
　　 目的:研究經(jīng)地塞米松作用及停用后GR表達(dá)的后續(xù)變化趨勢(shì)；觀察他克莫司對(duì)GR表達(dá)是否有影響；比較地塞米松和/或他克莫司以不同的組合方式作用時(shí)對(duì)GR表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 研究他克莫司對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的HaCaT細(xì)胞胞核核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的調(diào)節(jié)；觀察在上述GRα表達(dá)變化的同時(shí)HSP90的表達(dá)變化。以上研究旨在進(jìn)一步探討激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象的機(jī)制及他克莫司的抗炎機(jī)制，為他克莫司外用制劑治

5、療炎癥性皮膚病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于臨床上合理地將激素與他克莫司外用制劑聯(lián)合應(yīng)用，從而有效地延緩或改善激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象，具有指導(dǎo)意義。
　　 方法:
　　 以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞——HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，采用細(xì)胞培養(yǎng)、real time-RTPCR、Western blot和免疫熒光-激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)，主要進(jìn)行了以下幾方面的實(shí)驗(yàn)研究：
　　 1.以10-6mol/L地塞米松作用HaCaT細(xì)胞48h

6、后，再停用地塞米松，觀察經(jīng)地塞米松作用后24h、48h以及地塞米松停用后24h、48h、72h的GRα和GRβ表達(dá)。
　　 2.以10-8mol/L、10-7mol/L或10-6mol/L他克莫司作用HaCaT細(xì)胞，觀察12h、24h和36h的GRα和GRβ表達(dá)。
　　 3.以10-6mol/L地塞米松和(或)10-6mol/L他克莫司作用HaCaT細(xì)胞，分設(shè)5組：對(duì)照組(未處理組)、地塞米松作用48h組、他克莫司作用4

7、8h組、地塞米松先作用24h+他克莫司后作用24h組、他克莫司先作用24h+地塞米松后作用24h組，其中后2組分別指以10-6mol/L地塞米松(或他克莫司)作用24h后，再換10-6mol/L他克莫司(或地塞米松)繼續(xù)作用24h。觀察GRα和GRβ的表達(dá)。
　　 4.以TNF-α(10ng/ml)單獨(dú)或TNF-α(10ng/ml)與他克莫司(10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l)同時(shí)作用HaCaT細(xì)胞，觀

8、察24h和48h胞核NF-κB的表達(dá)。
　　 5.觀察1、2、3的處理方式下HSP90的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.以10-6mol/L 地塞米松作用于HaCaT 細(xì)胞后的48h 內(nèi)，GRα(mRNA和蛋白質(zhì))表達(dá)下調(diào)，GRβ(mRNA和蛋白質(zhì))表達(dá)上調(diào)；隨后在地塞米松停用后的72h 內(nèi)，已發(fā)生變化的GRα和GRβ均有不同程度地向原有水平恢復(fù)的趨勢(shì)。
　　 2.不同濃度的他克莫司(10-8mol/

9、L、10-7mol/L、10-6mol/L)對(duì)HaCaT 細(xì)胞GRα和GRβ的表達(dá)(包括mRNA和蛋白質(zhì)水平)均沒(méi)有明顯的影響。
　　 3.以地塞米松(10-6mol/L)作用HaCaT 細(xì)胞48h 后，GRα表達(dá)下調(diào)，GRβ表達(dá)上調(diào)；以他克莫司(10-6mol/L)作用HaCaT 細(xì)胞48h 后，GRα和GRβ表達(dá)無(wú)明顯變化，以地塞米松(10-6mol/L)和他克莫司(10-6mol/L)按不同的先后順序分別作用HaCaT 細(xì)

10、胞24h 后，GRα表達(dá)下調(diào)以及GRβ表達(dá)上調(diào)的程度均較單獨(dú)地塞米松作用48h 時(shí)低。
　　 4.他克莫司(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)能以濃度依賴性的方式抑制TNF-α(10ng/mL)刺激的HaCaT 細(xì)胞胞核中NF-κB的表達(dá)增加。5.10-6mol/L 地塞米松作用于HaCaT 細(xì)胞后的48h 內(nèi)，HSP90(mRNA和蛋白質(zhì))表達(dá)上調(diào)，隨后在地塞米松停用后的72h 內(nèi)，HSP90 表達(dá)有

11、所回落；他克莫司對(duì)HSP90的表達(dá)無(wú)明顯影響；將地塞米松或他克莫司以不同的先后順序依次作用HaCaT 細(xì)胞24h 后HSP90 升高的程度低于單獨(dú)以地塞米松作用48h 時(shí)的相應(yīng)變化。
　　 結(jié)論:
　　 地塞米松下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞中GRα表達(dá)并上調(diào)GRβ和HSP90的表達(dá)，這可能部分解釋持續(xù)外用激素制劑后出現(xiàn)的激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象，地塞米松停用后，上述基因均呈現(xiàn)向其原有水平恢復(fù)的趨勢(shì)，可能提示當(dāng)外用激素停用后，由激素引起

12、的皮膚局部對(duì)激素敏感性的減弱將有所恢復(fù)，因此臨床上外用激素治療應(yīng)避免長(zhǎng)期連續(xù)使用；他克莫司不影響GRα、GRβ和HSP90的表達(dá)，并且能以濃度依賴性方式抑制TNF-α刺激的NF-κB 表達(dá)增加，提示他克莫司能在皮膚局部發(fā)揮其抗炎作用而又不影響激素的敏感性；地塞米松聯(lián)合他克莫司作用比單獨(dú)地塞米松作用時(shí)調(diào)節(jié)GRα、GRβ和HSP90表達(dá)的程度低，提示臨床上激素與他克莫司配合使用時(shí)影響皮膚局部對(duì)激素治療敏感性的程度比單獨(dú)使用激素時(shí)要低，證明激