支氣管肺發(fā)育不良模型中ZONAB調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是圍生期肺損傷造成的一種慢性呼吸疾病，是早產(chǎn)造成的最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。最早是在1967年由Northway報(bào)道并命名，在早產(chǎn)兒中常見，具有特殊的臨床、組織學(xué)及影像學(xué)特征。BPD患兒需要長(zhǎng)期吸氧，即使出院后也有很大部分需要家庭氧療，且預(yù)后可能長(zhǎng)期遺留呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。隨著早產(chǎn)兒，特別是極低出生體重兒(very low birth weight，VL

2、BW)生存率的提高，BPD發(fā)生率仍然居高不下。
　　哺乳動(dòng)物有兩種肺泡上皮細(xì)胞，兩者互相協(xié)調(diào)以維持正常的氣體交換功能。Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅠ alveolar epithelial cells，AECⅠ)覆蓋近96％肺泡腔，與鄰近的毛細(xì)血管壁緊密相貼，是氣血屏障的主要上皮成分，具有氣體交換功能。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（TypeⅡ alveolar epithelial cells，AECⅡ）是肺泡上皮細(xì)胞的“祖細(xì)胞”，既能增殖成新

3、的AECⅡ，還可以轉(zhuǎn)分化為AECⅠ，肺損傷時(shí)AECⅡ向AECⅠ轉(zhuǎn)分化是損傷修復(fù)的一種重要機(jī)制。AECⅡ損傷一直被認(rèn)為是BPD肺上皮損傷的關(guān)鍵機(jī)制，許多研究發(fā)現(xiàn)BPD中AECⅡ發(fā)生壞死、凋亡、DNA損傷、氧化應(yīng)激損傷等，并認(rèn)為是BPD發(fā)生的病理基礎(chǔ)。但我們前期研究發(fā)現(xiàn)AECⅡ特異性標(biāo)志物SP-C不但沒有減少反而增加，表明在BPD發(fā)生時(shí)并沒有AECⅡ功能的改變，提示AECⅡ損傷并非BPD肺上皮修復(fù)障礙的唯一機(jī)制。那么是否存在AECⅡ向AEC

4、Ⅰ轉(zhuǎn)分化異常呢，是否存在AECⅡ增殖異常呢。目前關(guān)于調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及增殖異常機(jī)制的研究尚不完善。
　　我們已有研究發(fā)現(xiàn)高氧致肺損傷時(shí)密閉小帶(ZO)蛋白-1及跨膜蛋白o(hù)ccludin表達(dá)減少，且考慮與同時(shí)存在的肺泡上皮緊密連接開放及肺水腫發(fā)生有關(guān)。ZO-1有4種結(jié)構(gòu)域:PDZ，SH3，GK和酸性結(jié)構(gòu)域，其通過PDZ結(jié)構(gòu)域與occludin結(jié)合，通過SH3結(jié)構(gòu)域與ZO-1-associated nucleic acid bi

5、nding proteins(ZONAB)結(jié)合。ZONAB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和腎臟近曲小管細(xì)胞等的研究中發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄活性。ZONAB穿梭于緊密連接與細(xì)胞核之間，ZONAB位于核內(nèi)時(shí)能夠參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，與ZO-1的結(jié)合使ZONAB局限于細(xì)胞質(zhì)，抑制了ZONAB的轉(zhuǎn)錄活性。由此我們推測(cè)，ZO-1通過與occludin結(jié)合參與高氧致肺損傷時(shí)肺水腫的發(fā)生，是否同時(shí)通過與ZONAB的結(jié)合在另一途徑

6、中參與調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)分化進(jìn)而介導(dǎo)BPD發(fā)生呢。那么BPD模型中轉(zhuǎn)分化及增殖異常的調(diào)節(jié)因素中是否有ZONAB參與呢。
　　因此，我們?cè)谌齻€(gè)水平上檢測(cè)了肺泡上皮細(xì)胞中肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和增殖水平及ZONAB的表達(dá)情況:(1)高氧致新生鼠BPD動(dòng)物模型及對(duì)照組的肺組織;(2)從動(dòng)物模型肺組織分離的AECⅡ標(biāo)本;(3)從正常新生鼠分離的AECⅡ體外正常及高氧條件下原代培養(yǎng)。然后應(yīng)用體外原代培養(yǎng)的AECⅡ?yàn)槟Ｐ?，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及

7、siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)ZONAB表達(dá)量，觀察細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化指標(biāo)變化，以驗(yàn)證ZONAB對(duì)肺泡上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)作用。從而說明在高氧致BPD模型中轉(zhuǎn)錄因子ZONAB對(duì)肺泡上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)BPD發(fā)病機(jī)制和病理生理基礎(chǔ)開辟新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方法:
　　一、動(dòng)物模型制備與標(biāo)本采集
　　足月新生Wistar大鼠（連同母鼠）于生后12h(0d)內(nèi)隨機(jī)分為2組:BPD模型組（吸入氧濃度為8

8、5％）和對(duì)照組（吸入空氣）。將模型組新生大鼠在生后12h內(nèi)置于玻璃氧艙中，持續(xù)輸入氧氣，維持氧濃度在85％（測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)）。于暴露第1、3、7、14、21天分別從兩組動(dòng)物中隨機(jī)抽取8只麻醉后取肺組織留標(biāo)本。
　　二、細(xì)胞分離及培養(yǎng)
　　1、新生鼠AECⅡ分離:生后24小時(shí)以內(nèi)的新生鼠，經(jīng)5％水合氯醛腹腔麻醉后處死，無菌條件下迅速取肺，剪碎、漂洗后，采用胰酶、膠原酶分步消化，經(jīng)差速離心、差速貼壁、IgG免疫黏附、次日換液等方法純

9、化后，得到較純的AECⅡ。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力在95％以上，表面活性蛋白C(surfactantassociated protein C，SP-C)免疫熒光染色顯示細(xì)胞純度為90％。
　　2、原代細(xì)胞培養(yǎng):分離細(xì)胞24小時(shí)后換液，之后隨機(jī)分為模型組及對(duì)照組。模型組置于高氧孵箱(85％ O2-5％ CO2)中，對(duì)照組置于普通孵箱(21％ O2-5％CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　3、從BPD模型組及對(duì)照組鼠肺中分離AECⅡ

10、: BPD模型組及對(duì)照組大鼠在高氧或空氣暴露7，14，21天時(shí)，予以麻醉及分離肺組織，提取AECⅡ，具體方法同上。
　　三、細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及siRNA轉(zhuǎn)染
　　體外原代培養(yǎng)的由新生鼠分離的AECⅡ，利用轉(zhuǎn)染試劑Attractene轉(zhuǎn)染ZONAB過表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-ZONAB及空載體pCMV6，利用轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT1轉(zhuǎn)染ZONAB特異性siRNA和非特異性siRNA。
　　四、實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)
　?。?/p>

11、一）肺組織HE染色:普通光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變，測(cè)定輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radial alveolar counts，RAC)值。
　?。ǘ┑怪孟嗖铒@微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
　?。ㄈ┙M織免疫熒光染色:觀察肺泡上皮細(xì)胞ZONAB/表面活性蛋白C(surfactant associated protein C，SP-C)共表達(dá)、肺內(nèi)支氣管上皮ZONAB表達(dá)及肺泡上皮細(xì)胞水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)/SP-C共

12、表達(dá)情況。
　　（四）細(xì)胞免疫熒光:觀察模型組與對(duì)照組的體外原代培養(yǎng)AECⅡ中ZONAB表達(dá)、AQP5/SP-C共表達(dá)情況，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染pCMV6-ZONAB與空載體pCMV6組AQP5/SP-C共表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染ZONAB特異性siRNA與非特異性siRNA組AQPS/SP-C共表達(dá)情況。
　?。ㄎ澹﹚estern blot:檢測(cè)組織及細(xì)胞標(biāo)本的ZONAB（總蛋白及核蛋白）、AQP5、SP-C、PCNA、cyclin D1等蛋白

13、表達(dá)情況。
　?。﹔eal-time PCR:檢測(cè)組織及細(xì)胞標(biāo)本的ZONAB、AQP5、SP-C、PCNA等mRNA表達(dá)情況。
　　（七）透射電鏡:觀察肺組織肺泡上皮細(xì)胞、緊密連接及氣血屏障的超微結(jié)構(gòu)。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)間比較采用未配對(duì)t檢驗(yàn)，兩樣本率間比較采用x2檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

14、
　　一、肺組織的形態(tài)學(xué)改變
　　1、HE染色光鏡觀察形態(tài)學(xué)改變
　　觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織損傷越來越嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為肺泡化受阻，符合BPD的病理特點(diǎn)。
　　2、兩組大鼠肺組織RAC值對(duì)比
　　輻射狀肺泡計(jì)數(shù)（RAC）是評(píng)價(jià)肺發(fā)育的一項(xiàng)重要指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPD模型組從高氧暴露7d開始肺泡數(shù)量明顯較對(duì)照組減少(P＜0.05)，暴露14天和21天變化更加明顯(P＜0.001)，提示出現(xiàn)肺泡化受

15、阻。
　　二、BPD模型肺組織中AECII轉(zhuǎn)分化增多
　　組織免疫熒光雙標(biāo)染色中，BPD模型組從高氧暴露7d開始SP-C及AQP5表達(dá)均較對(duì)照組增多、紊亂，且雙染細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多。經(jīng)過量化后，雙染細(xì)胞/SP-C陽性細(xì)胞百分比在模型組中從高氧暴露7天開始明顯升高(p＜0.001)，提示BPD模型組鼠肺組織內(nèi)肺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化水平明顯增高。
　　western blot及real-time PCR方法定量后發(fā)現(xiàn)，模型組

16、從高氧暴露1d開始AQP5表達(dá)口有所增加(p＜0.05)。SP-C表達(dá)在高氧暴露1d和3d較正常組略有減少，從7d起模型組表達(dá)較對(duì)照組增多，高氧暴露14d和21d模型組較對(duì)照組表達(dá)明顯增多(p＜0.05)。
　　三、BPD模型中肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及氣血屏障損傷，細(xì)胞間緊密連接開放
　　透射電鏡觀察結(jié)果顯示對(duì)照組鼠肺組織內(nèi)可見肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞器完整，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完好，連接致密，氣血屏障三層結(jié)構(gòu)清晰連貫。BPD模型

17、組中高氧暴露7d發(fā)現(xiàn)AECⅡ向AECⅠ發(fā)生轉(zhuǎn)分化，表現(xiàn)為:板層小體排出、空泡化，微絨毛減少，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核變扁平。上皮細(xì)胞之間的緊密連接不規(guī)則變寬，部分氣血屏障三層結(jié)構(gòu)融合，模糊不清。高氧14d發(fā)現(xiàn)AECⅠ形態(tài)變圓、孤立，突向肺泡腔，細(xì)胞核有切跡，核內(nèi)異染色質(zhì)邊集;AECⅡ破壞更嚴(yán)重，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核突向腔面，板層小體大量排出，氣血屏障局部不規(guī)則，三層結(jié)構(gòu)融合。高氧21 dAECⅠ之間及AECⅡ之間的緊密連接開放及氣血屏障局部模糊更

18、為普遍。
　　四、從BPD模型組和對(duì)照組鼠肺分離的細(xì)胞中AEC標(biāo)志物發(fā)生變化
　　Western blot和real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從高氧暴露7d開始模型組細(xì)胞AQP5表達(dá)較對(duì)照組增多(p＜0.05)，SP-C表達(dá)較對(duì)照組中減少(p＜0.05)。
　　五、新生鼠分離的AECⅡ在體外細(xì)胞培養(yǎng)中轉(zhuǎn)分化水平受環(huán)境氧濃度調(diào)控
　　倒置相差顯微鏡觀察可見分離后24h AECⅡ呈立方形島狀生長(zhǎng)，有較多偽足伸出。7

19、2h后對(duì)照組細(xì)胞伸展，體積變大，發(fā)生形態(tài)改變。模型組細(xì)胞伸展、肥大、變形更加明顯，且細(xì)胞總數(shù)減少，培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞增多。免疫熒光雙染觀察，分離24h后細(xì)胞內(nèi)主要為SP-C表達(dá)，AQP5表達(dá)很少。72h后兩組均有SP-C和AQP5共表達(dá)，提示都出現(xiàn)了AECⅡ向AECⅠ的轉(zhuǎn)分化。但與對(duì)照組相比，模型組共表達(dá)的細(xì)胞更多，AQP5表達(dá)更多，SP-C表達(dá)更少，說明轉(zhuǎn)分化程度更高。應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測(cè)AQ

20、P5和SP-C兩種細(xì)胞標(biāo)志物的蛋白和mRNA表達(dá)水平，結(jié)果也提示模型組中AQP5表達(dá)升高，SP-C表達(dá)降低。
　　六、BPD模型組肺組織中ZONAB表達(dá)異常
　　1、western blot方法檢測(cè)肺組織內(nèi)ZONAB表達(dá)
　　BPD模型組較對(duì)照組比較，從高氧暴露1天開始ZONAB的表達(dá)量即有所增加，且這種增加的趨勢(shì)持續(xù)至高氧暴露21天(P＜0.05)。
　　2、肺泡上皮免疫熒光雙標(biāo)ZONAB/SP-C
　　

21、BPD模型組中高氧暴露14天和21天時(shí)標(biāo)記為紅色的AECⅡ中幾乎沒有綠色熒光表達(dá)，提示AECⅡ表達(dá)ZONAB明顯減少。
　　3、支氣管上皮表達(dá)ZONAB
　　ZONAB在模型組支氣管上皮細(xì)胞中從高氧暴露7天開始表達(dá)即較對(duì)照組增加。
　　七、從BPD模型組和對(duì)照組鼠肺分離的AECⅡ中ZONAB表達(dá)變化
　　為了去除肺組織內(nèi)其他細(xì)胞成分的影響，我們從對(duì)照組及BPD模型組不同時(shí)間點(diǎn)（7天，14天，21天）的鼠肺內(nèi)分離了

22、AECⅡ，并直接從取得的細(xì)胞標(biāo)本中提取目的蛋白及mRNA進(jìn)一步定量。Western blot及real-time PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)從高氧暴露7天開始模型組ZONAB表達(dá)較對(duì)照組減少(P＜0.001)。
　　八、體外原代培養(yǎng)的AECⅡ中ZONAB表達(dá)情況
　　細(xì)胞免疫熒光染色可見對(duì)照組中ZONAB表達(dá)較多，且多位于細(xì)胞連接處及細(xì)胞核內(nèi)，而模型組ZONAB表達(dá)量較少，且聚集于胞漿，細(xì)胞連接處及核內(nèi)均很少。western blot

23、及real-time PCR方法檢測(cè)ZONAB的蛋白及mRNA表達(dá)情況，均提示模型組較對(duì)照組表達(dá)減少，且細(xì)胞核內(nèi)ZONAB蛋白表達(dá)量下降更明顯。
　　九、ZONAB過表達(dá)促進(jìn)AECⅡ增殖，抑制其轉(zhuǎn)分化
　　1、轉(zhuǎn)染pCMV6-ZONAB后細(xì)胞表達(dá)ZONAB增加
　　原代培養(yǎng)的AECⅡ轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，應(yīng)用real-time PCR及western blot方法驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pCMV6-ZONAB）表達(dá)ZONAB較對(duì)

24、照組（轉(zhuǎn)染pCMV6）明顯增加，細(xì)胞核內(nèi)ZONAB也明顯增加。
　　2、轉(zhuǎn)染pCMV6-ZONAB后細(xì)胞轉(zhuǎn)分化減少
　　原代培養(yǎng)的AECⅡ轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，AECⅠ標(biāo)志物AQP5表達(dá)明顯減少，AECⅡ標(biāo)志物SP-C表達(dá)明顯增多，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)分化水平降低。細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)可見實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組AQP5表達(dá)減少，SP-C表達(dá)增多。
　　3、轉(zhuǎn)染pCMV6-ZONAB后細(xì)胞增殖增加
　　原代培養(yǎng)的AECⅡ轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，細(xì)胞增殖指標(biāo)P

25、CNA及cyclin D1表達(dá)明顯增多，提示細(xì)胞增殖水平增高。
　　十、ZONAB低表達(dá)促進(jìn)AECⅡ轉(zhuǎn)分化，抑制其增殖
　　1、轉(zhuǎn)染ZONAB siRNA后細(xì)胞表達(dá)ZONAB減少
　　原代培養(yǎng)的AECⅡ轉(zhuǎn)染ZONABsiRNA后，應(yīng)用real-time PCR及western blot方法驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染特異性siRNA）表達(dá)ZONAB較對(duì)照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA）明顯減少，細(xì)胞核內(nèi)ZONAB表達(dá)也明顯減少

26、。
　　2、轉(zhuǎn)染ZONAB siRNA后細(xì)胞轉(zhuǎn)分化增加
　　原代培養(yǎng)的AECⅡ轉(zhuǎn)染特異性siRNA后，AECⅠ標(biāo)志物AQP5表達(dá)明顯增多，AECⅡ標(biāo)志物SP-C表達(dá)明顯減少，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)分化水平增高.細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)可見實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組AQP5表達(dá)增多，SP-C表達(dá)減少。
　　3、轉(zhuǎn)染ZONAB siRNA后細(xì)胞增殖減少
　　原代培養(yǎng)的AECⅡ轉(zhuǎn)染特異性siRNA后，細(xì)胞增殖指標(biāo)PCNA及cyclin D1表達(dá)明顯減

27、少，提示細(xì)胞增殖水平降低。
　　結(jié)論:
　　1、在體內(nèi)及體外支氣管肺發(fā)育不良模型中，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞不但無增殖障礙，而且向Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化增多。
　　2、支氣管肺發(fā)育不良模型中，雖然Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化均增多，但仍然不能彌補(bǔ)肺上皮屏障功能的破壞。
　　3、ZONAB作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在正常發(fā)育的肺泡上皮中有表達(dá)，但暴露于高氧后型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)ZONAB減少，這種ZONAB表達(dá)異