中華蜜蜂頭部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性研究.pdf

1、大蜂螨(狄氏瓦螨，Varroa destructor)是嚴(yán)重危害西方蜜蜂(Apis mellifera，主要是意大利蜜蜂，即意蜂A．mellifera lingustica)的蜂螨，但大蜂螨對(duì)原產(chǎn)于我國(guó)的中華蜜蜂(中蜂，Apis ceranacerana)則沒(méi)有明顯的危害。其原因是中蜂為大蜂螨的原始寄主，在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，該蜂已經(jīng)形成了很強(qiáng)的防衛(wèi)機(jī)制和行為。中蜂的這種抗螨特異性是可遺傳的，因此本研究在構(gòu)建中蜂頭部cDNA芯片的基礎(chǔ)上

2、，對(duì)中蜂抗螨性的分子機(jī)制進(jìn)行了探索分析。
　　 主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1．利用已構(gòu)建好的中蜂頭部cDNA文庫(kù)，從8569條高質(zhì)量ESTs序列中，共拼接出基本覆蓋所有序列217條Contigs、788條singlets，由此獲得基因芯片的1025條候選ESTs。通過(guò)PCR擴(kuò)增，最終獲得717條高質(zhì)量ESTs。通過(guò)BLAST檢索，對(duì)ESTs序列進(jìn)行了功能注釋，其中有功能尚不明確的ESTs588條，功能明確的基因129條。

3、對(duì)這129條基因進(jìn)行了Gene Ontology分類(lèi)，按照細(xì)胞功能(Molecular function)、生物過(guò)程(Biological process)以及細(xì)胞組分(Cellulalcomponent)，將ESTs分成三類(lèi)，并統(tǒng)計(jì)了每大類(lèi)下各小類(lèi)的分布情況。構(gòu)建了較為完善的cDNA芯片數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　 2．對(duì)候選ESTs進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和純化，采用點(diǎn)樣法完成了中蜂頭部cDNA芯片制備。該芯片分為三個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣又分為4個(gè)亞矩

4、陣，每個(gè)矩陣含有717×2個(gè)ESTs探針。每張芯片設(shè)計(jì)三個(gè)矩陣既可以同時(shí)進(jìn)行三次重復(fù)，也可以同時(shí)檢測(cè)三個(gè)不同樣品，具有高通量，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)芯片掃描檢測(cè)結(jié)果表明，該芯片矩陣排布整齊，探針點(diǎn)形狀規(guī)則，直徑為90.63±15.87μm，熒光背景低，無(wú)連點(diǎn)，2個(gè)重復(fù)點(diǎn)大小形狀基本上一致，信號(hào)的差異系數(shù)大于0.33的低于30％，點(diǎn)樣成功率超過(guò)97％。結(jié)果表明，該基因芯片探針點(diǎn)大小均一，點(diǎn)制的重復(fù)性好。
　　 3．標(biāo)記新出房中蜂、意蜂

5、工蜂，定期回捕后，用活蜂螨接種麻醉工蜂，籠養(yǎng)3日進(jìn)行脅迫。分別提取四種不同處理的蜜蜂樣本，包括螨脅迫中蜂組和意蜂組，中蜂對(duì)照組和意蜂對(duì)照組的頭部總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并作熒光標(biāo)記，兩兩組合后分別與中蜂頭部cDNA芯片進(jìn)行雜交，芯片掃描，雜交結(jié)果分析。經(jīng)初步分析，篩選出了與抗螨性相關(guān)的18條差異表達(dá)ESTs，并對(duì)其中的卵黃蛋白原Vitellogenin、化學(xué)感受態(tài)蛋白ASP3和α—1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Alpha—(1，3)—fuco