IL-1β對(duì)體外培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的:
　　在哮喘的氣道重塑中，人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblast，HELF，MRC-5)活化后，發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)換成肌成纖維細(xì)胞，并特征性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)。本研究通過外源性白介素-1β（IL-1β）刺激體外培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖、α-SMAmRNA和α-SMA蛋白水平，以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)的表達(dá)水平，

2、從而探討氣道重塑與氣道炎癥之間的相互調(diào)控關(guān)系。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分:(1)經(jīng)不同濃度IL-1β刺激MRC-5細(xì)胞48h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)、Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的mRNA和蛋白水平。并收集細(xì)胞上清液，雙抗體夾

3、心ELISA(ABC-ELISA)法檢測(cè)NGF的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組（分為A2、A3、A4、A5四個(gè)亞組）分別加入終濃度為0.1 ng/ml、1ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml的IL-1β;對(duì)照組(A1組)加等量培養(yǎng)液。(2)經(jīng)IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細(xì)胞不同時(shí)間，同樣采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)、Western blotting檢測(cè)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物:α-平

4、滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白水平。同時(shí)也收集細(xì)胞上清液，ABC-ELISA法檢測(cè)NGF的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組（B組）加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，分為B1、B2、B3、B4四個(gè)亞組;對(duì)照組（C組）加入等量培養(yǎng)基，分為C1、C2、C3、C4組四個(gè)亞組分別培養(yǎng)0h、24h、48h、72h。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:
　　1.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較
　　

5、實(shí)驗(yàn)組（分為A2、A3、A4、A5四個(gè)亞組）分別加入終濃度為0.1 ng/ml、1ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml的IL-1β，對(duì)照組(A1組)加等量培養(yǎng)液，在×100倍倒置顯微鏡下觀察48h后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和低濃度組細(xì)胞呈有梭形、大多角形、扁平星形等，細(xì)胞核呈不規(guī)則的橢圓形或長(zhǎng)方形，細(xì)胞突起粗短;隨著藥物IL-1β刺激濃度的增加，MRC-5細(xì)胞呈長(zhǎng)條索狀，生長(zhǎng)加快，細(xì)胞更加密集，呈渦旋狀、放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞突起呈

6、細(xì)長(zhǎng)絲狀（見圖1-5）。
　　1.2經(jīng)IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較
　　實(shí)驗(yàn)組（B組）加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，分為B1、B2、B3、B4四個(gè)亞組;對(duì)照組（C組）加入等量培養(yǎng)基，分為C1、C2、C3、C4四個(gè)亞組分別培養(yǎng)0h、24h、48h、72h。鏡下發(fā)現(xiàn)隨著藥物IL-1β作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MRC-5細(xì)胞融合度更高，細(xì)胞密度更大，細(xì)胞突起更細(xì)長(zhǎng)，B4細(xì)胞彼此之間結(jié)構(gòu)紊亂

7、，甚至極性消失。
　　2.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　2.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細(xì)胞的OD值比較
　　A3組1.124±0.020，A4組1.149±0.017，A5組1.162±0.016的MRC-5細(xì)胞OD值，均明顯高于A1組1.015±0.031及A2組1.028±0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而A2組與A1組無明顯差異(P＞0.05)。除A4組外，A5組明顯高于其他各組(P＜0.0

8、5)，A5組的細(xì)胞增殖程度相當(dāng)于對(duì)照組A1組的1.1倍。說明IL-1β濃度依賴性地促進(jìn)了MRC-5細(xì)胞增殖。
　　2.2 IL-1β10ng/ml刺激MRC-5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較
　　應(yīng)用CCK8法測(cè)定MRC-5細(xì)胞0h、24h、48h、72h的OD值，并繪制生長(zhǎng)曲線（圖15）。B2組1.143±0.016，B3組1.162±0.016，B4組1.404±0.015分別高于C2組0.957±0.045，C3組1.01

9、5±0.031，C4組1.192±0.046;差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，即加用藥物IL-1β實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖速度，較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組明顯加快。而且B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，即隨時(shí)間的延長(zhǎng)OD值逐漸增大，在72h達(dá)到高峰，說明IL-1β時(shí)間依賴性地促進(jìn)了MRC-5細(xì)胞增殖。
　　3.RT-PCR法檢測(cè)MRC-5細(xì)胞的α-SMAmRNA表達(dá)情況
　　3.1不同濃度IL-1β

10、刺激MRC-5細(xì)胞α-SMAmRNA的表達(dá)結(jié)果
　　RT-PCR結(jié)果顯示，A3、A4、A5組所測(cè)灰度值(1.02±0.07、1.17±0.05、1.34±0.06)，均明顯高于A1組(0.59±0.04)及A2組(0.68±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而A1組與對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)。A5組顯著高于A1、A2、A3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但與A4組無明顯差異(P＞0.05)。說明IL-1β

11、濃度依賴性地促進(jìn)了MRC-5細(xì)胞的α-SMAmRNA的表達(dá)水平。
　　3.2 IL-1β10ng/ml刺激MRC-5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的α-SMAmRNA表達(dá)結(jié)果
　　B1組0.49±0.04、B2組0.66±0.04、B3組1.35±0.05、B4組1.65±0.05，C1組0.47±0.02、C2組0.50±0.03、C3組0.56±0.04、C4組0.63±0.05。在正常對(duì)照組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，雖也有少量α-SMAmRNA表

12、達(dá)，但C1組、C2組、C3組和C4組共四組，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較結(jié)果顯示:B2組高于C2組、B3組高于C3組、B4組高于C4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMAmRNA表達(dá)量逐漸增高，并在72h達(dá)到高峰，B4組的α-SMAmRNA表達(dá)量是B1組的3.4倍，另外B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明IL-1β時(shí)間依賴性地促

13、進(jìn)了MRC-5細(xì)胞的α-SMAmRNA的表達(dá)水平。
　　4.蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)α-SMA蛋白的表達(dá)情況
　　4.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)組A2組3.16±0.06，A3組5.05±0.13，A4組5.85±0.10，A5組6.36±0.13均明顯高于對(duì)照組A1組1.79±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。A5組α-SMA蛋白的

14、表達(dá)水平最高，是A1組的3.6倍，且顯著高于A1、A2、A3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。提示高濃度的IL-1β能較強(qiáng)刺激MRC-5細(xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白的作用，即濃度依賴效應(yīng)。
　　4.2 IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的α-SMA蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　在正常對(duì)照組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，也有少量α-SMA蛋白表達(dá)，但C1組0.19±0.02，C2組0.21±0.02，C3組0.24±0.03和C4組0

15、.25±0.02共四組，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較結(jié)果顯示:B1組0.47±0.05和C1組1.06±0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); B2組1.06±0.05高于C2組、B3組1.79±0.04高于C3組、B4組1.92±0.04高于C4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，另外隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，α-SMA蛋

16、白表達(dá)量逐漸增高，并在72h達(dá)到高峰，B4組的α-SMA蛋白表達(dá)量較B1組增加了3倍，提示IL-1β時(shí)間依賴性地促進(jìn)了MRC-5細(xì)胞的α-SMA蛋白的表達(dá)水平。
　　5.ABC-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NGF(pg/ml)的表達(dá)水平
　　5.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細(xì)胞上清液中NGF的表達(dá)水平
　　實(shí)驗(yàn)組A3組59.57±4.11，A4組91.25±3.49，A5組92.59±5.10均明顯高于對(duì)照組A1

17、組44.18±2.71和A2組44.55±2.84，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但A2組與A1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。A5組NGF的表達(dá)水平最高，顯著高于A1/A2和A3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);但與A4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示高濃度的IL-1β能較強(qiáng)刺激MRC-5細(xì)胞分泌NGF的作用，即濃度依賴效應(yīng)。
　　5.2 IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的上清液中NGF

18、的表達(dá)水平
　　在正常對(duì)照組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即C1組42.40±2.78，C2組42.90±3.39，C3組42.61±3.07和C4組42.57±3.09共四組，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較結(jié)果顯示:B2組67.51±6.92高于C2組，B3組92.76±4.33高于C3組，B4組101.87±5.28高于C4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，