Fbxw7參與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞肝癌（HCC）是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其在腫瘤相關(guān)疾病中的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在我國(guó)，肝癌在所有腫瘤中發(fā)病率居第四位，而死亡率在腫瘤相關(guān)性死亡中居第二位。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，盡管出現(xiàn)了日益先進(jìn)的診斷技術(shù)，漸漸規(guī)范精湛的外科手術(shù)，還有逐步改善的輔助性化療，甚至肝移植技術(shù)的普及，可是肝癌患者的預(yù)后依然不容樂(lè)觀。這都是由于肝癌的隱匿性發(fā)展和不可預(yù)知的轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者在就診時(shí)就已經(jīng)失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，而術(shù)后復(fù)發(fā)和腫瘤

2、耐藥問(wèn)題，更是導(dǎo)致肝癌患者死亡的決定性因素。談“肝癌”色變，仍然是當(dāng)前患者和醫(yī)生的深刻感觸。醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，離不開(kāi)醫(yī)學(xué)科研的不斷進(jìn)步，迄今為止，世界各地的學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種和肝癌生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等相關(guān)的分子及通路機(jī)制，而科研中取得的成果，諸如分子靶向治療，干細(xì)胞治療等等也在慢慢的向臨床轉(zhuǎn)化。治愈肝癌任重而道遠(yuǎn)，其困難源于肝癌背后的機(jī)制過(guò)于復(fù)雜，另外，90％以上腫瘤患者的死亡歸因于轉(zhuǎn)移的發(fā)生，因此，研究腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制和預(yù)防具有非常重

3、要的意義。
　　自從泛素—蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）被發(fā)現(xiàn)后，多方證實(shí)其參與了細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、周期調(diào)控、凋亡與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾體系。其中泛素連接酶E3中最核心的F-box蛋白—Fbxw7，可識(shí)別多個(gè)原癌蛋白并參與其泛素化和降解，發(fā)揮著抑制腫瘤的生物學(xué)功能，近年研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Fbxw7發(fā)生了基因突變或表達(dá)降低。
　　Fbxw7蛋白是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一，比較集中的研究方向有

4、干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，腫瘤增殖和侵襲，耐藥等等。但在肝癌方面的研究為數(shù)不多，集中涉及其在肝癌組織的表達(dá)情況及對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有Fbxw7在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的機(jī)制的報(bào)導(dǎo)，因此，本課題設(shè)計(jì)并施行了以下研究，為探求Fbxw7在肝癌轉(zhuǎn)移中是否起到了作用及其作用機(jī)制有哪些。
　　方法：首先收集并隨訪了102例肝癌患者的組織標(biāo)本，石蠟包埋并切片，利用免疫組化染色來(lái)觀察Fbxw7在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)情況，并與患者的

5、臨床病理資料結(jié)合來(lái)分析Fbxw7對(duì)于肝癌的意義，隨后用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系中Fbxw7的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。接下來(lái)構(gòu)建了能夠穩(wěn)定下調(diào)/上調(diào) Fbxw7的病毒載體并轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系，使肝癌細(xì)胞系可以穩(wěn)定下調(diào)/上調(diào)Fbxw7的表達(dá)，繼而使用Real-time PCR，Western-blot，ELISA，Transwell實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒后的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)

6、移相關(guān)指標(biāo)的改變，并探索其中涉及到的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化染色結(jié)果得知在肝癌組織中Fbxw7的表達(dá)比癌旁組織中要低。與臨床病理特征結(jié)合的分析結(jié)果顯示，高Fbxw7水平和低Fbxw7水平組患者之間，腫瘤分化（P=0.013），脈管浸潤(rùn)（P=0.031），轉(zhuǎn)移（P=0.027）和AJCC腫瘤分期（P=0.047）都是有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的。Kaplan-Meier法生存分析提示，高Fbxw7表達(dá)組患者有著更長(zhǎng)的生存時(shí)

7、間（log-rank，P<0.001）。單因素和多因素Cox回歸分析均表明，低Fbxw7表達(dá)能夠作為肝癌患者預(yù)后較差的獨(dú)立指標(biāo)。
　　2.以肝細(xì)胞系HL-7702為對(duì)照，使用Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系HepG2，SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表達(dá)情況，結(jié)果提示，肝癌細(xì)胞系中 Fbxw7的表達(dá)明顯低于肝細(xì)胞系（P<0.05），且在HepG2，SMMC7721和MHCC97H中

8、Fbxw7的表達(dá)水平是依次降低的。
　　3.構(gòu)建上調(diào)Fbxw7的GV341-puro慢病毒載體和下調(diào)Fbxw7的GV118-GFP慢病毒載體，根據(jù)細(xì)胞系中Fbxw7的相對(duì)高低水平選擇了在HepG2中下調(diào)Fbxw7，在MHCC97H中上調(diào)Fbxw7，轉(zhuǎn)染完畢后通過(guò)Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾效果，成功構(gòu)建了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H，他們各自的對(duì)照為NC-Fbxw7-G2

9、和NC-Fbxw7-97H。
　　4.在確定了病毒本身對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響的前提下，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)及裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)了Fbxw7表達(dá)的 KD-Fbxw7-G2細(xì)胞的侵襲和遷移能力較對(duì)照細(xì)胞有明顯的增強(qiáng)，而上調(diào)了Fbxw7表達(dá)的OE-Fbxw7-97H細(xì)胞的侵襲和遷移能力比對(duì)照細(xì)胞有明顯的減弱。
　　5.通過(guò) Western-blot，Real-time PCR及 ELISA檢測(cè)了KD-Fbxw7-G

10、2和OE-Fbxw7-97H細(xì)胞中活化的Notch1的變化情況，并檢測(cè)了ERK1/2通路的活化情況及MMP-2，MMP-9和uPA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制Fbxw7的表達(dá)可以上調(diào)Notch1的NICD的表達(dá)，并激活ERK1/2，繼而使MMP-2，MMP-9和uPA表達(dá)增加，而使用Notch1的小干擾RNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干擾后，本已增強(qiáng)的細(xì)胞遷移和侵襲的能力發(fā)生了回落。
　　結(jié)論：
　　研究結(jié)果表明，F(xiàn)bxw7可以用于肝癌患者的