FBXW7新的靶蛋白ENO1的鑒定及功能研究.pdf

1、研究背景：
　　FBXW7也稱 FBW7，是 F-box蛋白家族成員，為SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素連接酶體系的靶蛋白識別組分。人FBXW7基因定位于4號染色體(4q31.3)，其表達產物FBXW7的F-box基序和SKP1直接結合，形成SCFFBXW7復合體，并通過其WD40結構域識別特異性底物，介導靶底物的泛素化降解。FBXW7可靶向降解多種癌蛋白，如Cyclin E、c-Myc、mTOR、Notch1、HI

2、F-1α等，在細胞周期進程、細胞生長、分化、細胞凋亡、腫瘤轉移、腫瘤抗藥性等多個方面發(fā)揮重要調控作用。FBXW7是公認的腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中包括肺癌、胃癌、前列腺癌等存在功能性突變、缺失或表達降低。目前，FBXW7抑制腫瘤的機制尚不完全清楚，而其通過調控特定靶蛋白的含量參與腫瘤抑制作用是最常見的機制。迄今為止，已經鑒定的FBXW7底物比較局限，而FBXW7作用的靶底物不同，其抑癌機制也不同。因此，發(fā)現、鑒定FBXW7未知的靶底物，

3、研究其與靶底物的作用方式，對進一步明確FBXW7的抑癌機制有非常重要的意義，同時也為闡明FBXW7與其他腫瘤相關基因的調控及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。
　　烯醇酶1(enolase1，ENO1)是糖酵解過程中催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸的代謝關鍵酶，最終促進乳酸及ATP的生成。多項研究表明，除了參與糖酵解過程外，ENO1是體內重要的多功能蛋白，參與細胞生長調控、缺氧耐受、自身免疫調節(jié)等多種生理過程。現有的研究報道E

4、NO1在鼻咽癌、神經膠質瘤等多種腫瘤中表達增高，且其表達水平的高低和腫瘤的發(fā)展及不良預后有關;在細胞中過表達ENO1能夠促進細胞增殖，侵襲和轉移，表明ENO1可能作為一個癌蛋白促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，目前對于ENO1的具體表達調控機制尚不清楚。
　　我們在前期研究中以篩選鑒定FBXW7的靶蛋白為研究目標，利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)與質譜技術(MS)分離鑒定FBXW7基因敲除大腸癌細胞系HCT116 FBXW7-/-和

5、FBXW7野生型HCT116 FBXW7+/+中差異表達的蛋白質，結果發(fā)現體外敲除大腸癌細胞FBXW7的表達可明顯上調ENO1的表達，提示ENO1可能是FBXW7新的靶底物。本研究進一步從體外細胞實驗和人結直腸癌組織標本兩個層面深入探討了FBXW7對ENO1的調控作用及調控機理，該研究的完成發(fā)現和確認了新的FBXW7靶蛋白，揭示了FBXW7參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的新機制，為腫瘤的診斷和治療提供新的思路和靶點。
　　研究目的：

6、　　探討FBXW7對ENO1表達的調控作用及作用機理，并進一步闡明FBXW7通過調控ENO1影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　研究方法：
　　1.在多個細胞系及臨床組織標本中確定FBXW7對ENO1的調控作用
　　1)在FBXW7野生型結腸癌細胞HCT116 FBXW7+/+和DLD-1 FBXW7+/+及利用同源重組技術建立的FBXW7基因敲除的HCT116 FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7-/-細胞中，應用qRT

7、-PCR和Western blotting檢測ENO1的表達。
　　2)在前列腺癌細胞系PC3、Du145和乳腺癌細胞系MDA-MB-468中，通過RNA干擾技術建立FBXW7沉默表達的穩(wěn)定細胞系，應用qRT-PCR和Western blotting檢測ENO1的表達。
　　3)在HCT116 FBXW7-/-和HEK293細胞中轉染FBXW7真核表達載體，Western blotting檢測ENO1的表達。
　　4)

8、收集50例結直腸癌及癌旁組織，免疫組織化學方法檢測FBXW7和ENO1的表達，分析兩者的相關性。
　　2.進一步實驗確定FBXW7調控ENO1蛋白水平的機理
　　1)運用蛋白質免疫共沉淀技術檢測FBXW7和ENO1之間的相互作用。
　　2)在HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-細胞中，應用放線菌酮示蹤實驗檢測FBXW7對ENO1半衰期的影響。
　　3)應用蛋白酶體抑制劑MG132處理HCT116 FB

9、XW7+/+和FBXW7-/-細胞，Western blotting檢測ENO1水平的改變。
　　4)應用GSK3β特異的抑制劑GSK3β inhibitorⅧ處理HCT116FBXW7+/+和FBXW7-/-細胞，Western blotting檢測ENO1水平的改變。
　　5)運用蛋白質免疫共沉淀技術檢測FBXW7表達變化對ENO1的泛素化水平的影響。
　　3.檢測FBXW7調節(jié)ENO1的功能進而影響細胞的增殖和遷

10、移
　　1)應用ENO1特異的干擾RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-細胞中ENO1的表達，qRT-PCR檢測各組細胞中CCL20 mRNA的表達。
　　2)應用ENO1特異的干擾RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-細胞中ENO1的表達，ATP及乳酸檢測試劑盒檢測細胞內ATP及乳酸的含量，檢測FBXW7調控ENO1對細胞糖酵解代謝途徑的影響。
　　3)在ENO1過表達的HCT11

11、6 FBXW7+/+細胞中過表達FBXW7或在FBXW7敲除的HCT116 FBXW7-/-細胞中沉默ENO1的表達，運用MTT和劃痕實驗檢測FBXW7調控ENO1對腫瘤細胞增殖和遷移的影響。
　　研究結果：
　　1.FBXW7顯著下調ENO1蛋白的表達
　　1) Western blotting檢測結果顯示FBXW7基因敲除或沉默的細胞系中ENO1蛋白的表達顯著增加，而qRT-PCR結果顯示FBXW7基因敲除或沉默的

12、細胞系中ENO1 mRNA的表達沒有顯著性差異。
　　2) Western blotting檢測結果顯示在293T和HCT116FBXW7-/-細胞中過表達FBXW7，ENO1蛋白表達顯著降低。
　　3)免疫組織化學實驗結果顯示結腸癌組織中FBW7和ENO1水平成明顯的負相關。
　　2.FBXW7促進ENO1通過蛋白酶體途徑降解
　　1)蛋白質免疫共沉淀檢測結果顯示FBXW7和ENO1存在相互結合的作用。

13、　　2)放線菌酮示蹤實驗結果顯示FBXW7缺失延長ENO1蛋白的半衰期，FBXW7促進ENO1降解。
　　3) Western blotting結果顯示蛋白酶體抑制劑MG132和GSK3β inhibitorⅧ阻斷FBXW7缺失誘導的ENO1的表達升高。
　　4)蛋白質免疫共沉淀檢測顯示FBXW7可以促進ENO1的泛素化。
　　3.FBXW7調節(jié)ENO1的功能影響細胞CCL20 mRNA、ATP和乳酸產生及增殖和遷移能

14、力
　　1) qRT-PCR結果顯示FBXW7通過負性調控ENO1抑制細胞CCL20的表達。
　　2) ATP及乳酸含量檢測顯示FBXW7通過負性調控ENO1抑制細胞ATP和乳酸的產生。
　　3) MTT和劃痕實驗結果顯示FBXW7通過負性調控ENO1抑制結腸癌細胞的增殖和遷移。
　　研究結論和意義：
　　我們的研究結果表明FBXW7可以通過靶向降解ENO1，負性調控ENO1的功能從而抑制結腸癌細胞的增殖和