WISP1表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理表現(xiàn)的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的:
　　 2008年的研究表明，全世界食管癌發(fā)病率位居第八，死亡率位居第六;在我國則分別位居第五和第四。盡管食管癌的診斷和治療已經(jīng)取得許多進(jìn)步，但是發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已是局部晚期，并可能轉(zhuǎn)移至其它器官，導(dǎo)致預(yù)后不良。晚期或轉(zhuǎn)移食管癌患者通常對(duì)綜合治療表現(xiàn)出抵抗性，包括化學(xué)治療、放射治療甚至生物治療，因此食管癌是一種常見的低治愈率惡性腫瘤。為了進(jìn)一步了解食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，開發(fā)更佳診斷和治療策略，有必要從臨床病理學(xué)及分子水平進(jìn)一

2、步探索。
　　 WISP1是Cyr61-CTGF-Nov(CCN)生長因子家族的成員之一，在比較大鼠高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行RNA表達(dá)水平時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。CCN生長因子家族包括半朧氨酸富集蛋白(Cyr61/CCN1)，結(jié)締組織生長因子(CTGF/CCN2)和腎母細(xì)胞瘤過度表達(dá)基因(Nov/CCN3)，WISP1/CCN4/Elm1，WISP2/CCN5/rCop-1和WISP3/CCN6。他們是分泌型細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，結(jié)

3、構(gòu)相似，功能廣泛各異，包括細(xì)胞黏附、分裂、遷移和趨化、細(xì)胞存活、分化、軟骨形成、骨修復(fù)、血管生成及腫瘤發(fā)生。
　　 WISP1是Wnt(Wingless/int-1)/β-catenin通路的下游關(guān)鍵靶基因。Wnt/β-catenin通路是由Wnt受體激活的三條通路中研究最為徹底的，Wnt已經(jīng)被證明與人類退行性疾病及腫瘤存在密切關(guān)系。Wnt基因最初在乳腺癌中被認(rèn)為是乳腺癌病毒誘導(dǎo)的癌前基因。Wnt-1是Wnt配體，在食管鱗狀細(xì)胞

4、癌(ESCC)及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)中具有轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞生長的作用。WISP1（Wnt誘導(dǎo)的分泌蛋白1）基因位于染色體8q24.1～8q24.3，長度為211 bp，原始mRNA長4.5 kb，包含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，第1個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽，其余編碼4個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域[1，5，6]。WISP-1在人類多種組織器官中廣泛表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞遷移等生物學(xué)功能，WISP1通過旁分泌-自分泌

5、的方式導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，目前已在多種腫瘤中檢測WISP1蛋白并呈現(xiàn)不同表達(dá)水平。一些研究提示W(wǎng)ISP1的表達(dá)水平可能與某些臨床表現(xiàn)具有一定的相關(guān)性。NAGAI等研究了105例食管鱗狀細(xì)胞癌患者，WISP1表達(dá)與某些臨床病理學(xué)特征顯著相關(guān)。為進(jìn)一步論證WISP1在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用，本研究對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理學(xué)表現(xiàn)與WISP1表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行研究。
　　 患者和方法:
　　 組織樣本:本研究收集200

6、5-2009年在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院159例胸段食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)患者組織樣本，所有患者術(shù)前均未接受包括化學(xué)治療、放射治療等治療。常規(guī)蘇木精-伊紅染色及病理診斷在本院病理科完成。酒精固定、石蠟包埋切片層厚為4μm，免疫組織化學(xué)染色并組織病理學(xué)診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌。每例患者包括如下信息:年齡、性別、臨床病理學(xué)分期(TNM system，7th Edition of the AJCC Cancer StagingManual，2009)、

7、腫瘤部位、浸潤深度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。隨訪截止2012年12月31日。
　　 免疫組織化學(xué)染色:使用人類WISP1兔多克隆抗體按1∶50稀釋(Abcam，Cambridge，USA)對(duì)石蠟包埋組織切片染色。標(biāo)準(zhǔn)兔Ig G作為陰性對(duì)照。二抗為PV-6000通用二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑(ZSGB-BIO， Peking， China)。免疫組織化學(xué)染色步驟如下:1）70度烤箱2-3h，二甲苯脫蠟15min、梯度酒精水化組織

8、切片（100-95-85-75％每次3min）。2)0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)煮沸后放入1.5min復(fù)蘇抗原。3％H2O2去離子水（30％母液甲醇或水稀釋）封閉10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗。3）滴加一抗(1∶50)，4℃過夜。滴加二抗，37℃孵育15min，每次孵育均PBS沖洗5分鐘×3次。4）應(yīng)用DAB溶液顯色2-5min，蒸餾水沖洗、蘇木素復(fù)染30s、梯度酒精(75-85-95-100％)脫水、

9、二甲苯透明、封片。
　　 免疫反應(yīng)評(píng)分:為兩條評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的乘積，染色強(qiáng)度和著色細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色細(xì)胞比例:0，陰性;1，≤10％;2，11％-50％;3，51％-75％;4，≥75％。免疫反應(yīng)評(píng)分小于6定義為WISP1表達(dá)陰性，大于或等于6定義為陽性。所有切片由兩名有經(jīng)驗(yàn)的研究人員獨(dú)立進(jìn)行評(píng)分
　　 統(tǒng)計(jì)分析:計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率分析數(shù)據(jù)。顯

10、著性水平定義為P≤0.05。OS為手術(shù)日期至隨訪截止或死亡。Kaplan-Meier法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)用于單因素生存分析，多因素生存分析則采用Cox回歸。所有的統(tǒng)計(jì)分析使用PASW statistics18軟件進(jìn)行。
　　 結(jié)果:
　　 1.臨床病理學(xué)表現(xiàn)與WISP1蛋白表達(dá)
　　 所有切片組織病理學(xué)診斷為鱗狀細(xì)胞癌。食管鱗狀細(xì)胞癌WISP1表達(dá)陽性的典型免疫組織化學(xué)染色見圖1、2。食管癌細(xì)胞質(zhì)染色陽性，呈彌漫性，而

11、細(xì)胞基質(zhì)染色弱;周圍的正常鱗狀上皮細(xì)胞則鮮有WISP1免疫反應(yīng)現(xiàn)象。
　　 臨床病理學(xué)表現(xiàn)與WISP1蛋白表達(dá)的相關(guān)性見表2。159例患者中，WISP1（-）52例，WISP1(+)107例?？梢奧ISP1蛋白表達(dá)與腫瘤部位、浸潤深度及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。
　　 ①腫瘤位于上、中、下段的患者分別為10、98、51例，腫瘤部位與WISP1蛋白表達(dá)的卡方檢驗(yàn)P值=0.002，具有相關(guān)性。
　　 ②腫瘤浸潤至粘膜

12、、粘膜下層及固有肌層的患者分別為15、53、89例，浸潤深度與WISP1蛋白表達(dá)的卡方檢驗(yàn)P值=0.01，具有相關(guān)性。
　　 ③有無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者分別為99、60例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與WISP1蛋白表達(dá)的卡方檢驗(yàn)P值=0.05，具有相關(guān)性。
　　 ④有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者分別為36、123例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與WISP1蛋白表達(dá)的卡方檢驗(yàn)P值=0.054，無相關(guān)性。
　　 ⑤TNM分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的患者分別為25、72

13、、26、36例，TNM分期與WISP1蛋白表達(dá)的卡方檢驗(yàn)P值=0.083，無相關(guān)性。
　　 2.患者特征與WISP1蛋白表達(dá)
　　 159例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，男生139例，女性20例，中位年齡63.05歲，年齡40-83歲，性別與WISP1蛋白表達(dá)的卡方檢驗(yàn)P值=0.078，無相關(guān)性。
　　 3.生存分析
　　 WISP1表達(dá)生存曲線見圖3。從圖中可見，WISP1（-）的患者生存明顯優(yōu)于WISP1(+