人血漿中非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)分析方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、非對(duì)稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一種天然氨基酸，廣泛存在于組織和細(xì)胞中。在體內(nèi)它可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），調(diào)節(jié)一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成。游離的ADMA 主要是由肽鏈中富含精氨酸-甘氨酸的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）甲

2、基化后水解生成。它在體內(nèi)的消除80％是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的二甲基精氨酸二甲胺水解酶DDAH（dimethylargininedimethylaminohydrolase，DDAH）來(lái)完成，水解生成胍氨酸和二甲胺。ADMA在體內(nèi)還有一個(gè)同分異構(gòu)體-對(duì)稱性二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）。SDMA對(duì)NOS 沒(méi)有抑制作用，但可以競(jìng)爭(zhēng)精氨酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，影響NO 的生成。SDMA大多以原形經(jīng)腎排泄，可作為影響

3、腎功能的一個(gè)指標(biāo)。ADMA 作為一種內(nèi)源性的NOS 抑制劑而備受關(guān)注。在體內(nèi)它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO 的生成，增加氧自由基形成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增加單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙，并與脂代謝異常、高血壓、糖尿病、慢性腎功能衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化等諸多疾病密切相關(guān)。流行病學(xué)和前瞻性的醫(yī)學(xué)研究也證實(shí)，ADMA是血管內(nèi)皮功能障礙等相關(guān)疾病或急危重疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因子。鑒于ADMA/SDMA 在心血管疾病機(jī)制研究中的重要作用，建立一個(gè)快捷

4、、準(zhǔn)確和靈敏的分析方法顯得十分必要。目前國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)多數(shù)仍選擇HPLC 法作為檢測(cè)手段，只能檢測(cè)ADMA 一個(gè)化合物，生物樣品處理過(guò)程中需要加入衍生化試劑，操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間也過(guò)長(zhǎng)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：建立一個(gè)快捷、準(zhǔn)確、靈敏的LC-MS/MS方法同時(shí)測(cè)定人血漿中ADMA/SDMA的濃度。以右美沙芬為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，以乙腈：甲酸銨-甲酸緩沖溶液（含5 mmol·L-1 甲酸銨，0.1％甲酸）（5﹕

5、95，v/v）為流動(dòng)相，采用Hypercarb柱分離，通過(guò)電噴霧三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜，以選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）和正離子方式進(jìn)行檢測(cè)。用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 203.1→46（ADMA），m/z203.1→172.1（SDMA），m/z 272.2→171（內(nèi)標(biāo)）。ADMA 和SDMA 的線性范圍為0.12~2.48 μM，最低定量濃度為0.12 μM。日內(nèi)、日間精密度RSD<17.08％，準(zhǔn)確度（RE）在97.70％~107.2

6、7％范圍內(nèi)。對(duì)130 例臨床病例的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，正常對(duì)照組測(cè)得的ADMA 濃度在0.4~0.6 μM，與多數(shù)文獻(xiàn)測(cè)得的正常值范圍相符，而患有高血壓、糖尿病的人群血漿ADMA 值高于正常對(duì)照組，檢測(cè)方法可靠易行。
　　 第二部分：對(duì)130例臨床病例進(jìn)行了回顧性地分析，研究ADMA 濃度與臨床各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性。⑴首先對(duì)炎癥因子C 反應(yīng)蛋白與ADMA 的相關(guān)性作了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADMA 與C 反應(yīng)蛋白的相關(guān)性不顯著（P= 0.9

7、08），反而與SDMA 的濃度呈正相關(guān)（r = 0.196，P=0.042）；⑵其次按照疾病因素的不同對(duì)130 例臨床病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分為正常對(duì)照組、高血壓組、糖尿病組、高血壓合并糖尿病組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓組較正常組（0.63±0.13 vs.0.55±0.09, P=0.002），糖尿病組較正常組（0.62±0.11 vs. 0.55±0.09, P=0.038）高血壓合并糖尿病組較正常組（0.66±0.08 vs. 0.55±0.0

8、9, P=0.000），三個(gè)疾病組患者的ADMA 濃度都有顯著性的提升。而高血壓合并糖尿病組的血漿ADMA 濃度較單純高血壓組（0.66±0.08 vs. 0.63±0.13, P=0.208）或糖尿病的患者（0.66±0.08vs. 0.62±0.11, P=0.116）并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異；⑶進(jìn)一步加入腦血管病史、吸煙兩個(gè)心血管風(fēng)險(xiǎn)因素，再次進(jìn)行分組。風(fēng)險(xiǎn)因子個(gè)數(shù)0 為正常對(duì)照，1~2 為低風(fēng)險(xiǎn)組，大于2 為高風(fēng)險(xiǎn)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組之間