人血漿中非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)分析方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、非對稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一種天然氨基酸，廣泛存在于組織和細胞中。在體內(nèi)它可以競爭性地抑制一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），調(diào)節(jié)一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成。游離的ADMA 主要是由肽鏈中富含精氨酸-甘氨酸的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）甲

2、基化后水解生成。它在體內(nèi)的消除80％是通過細胞內(nèi)的二甲基精氨酸二甲胺水解酶DDAH（dimethylargininedimethylaminohydrolase，DDAH）來完成，水解生成胍氨酸和二甲胺。ADMA在體內(nèi)還有一個同分異構(gòu)體-對稱性二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）。SDMA對NOS 沒有抑制作用，但可以競爭精氨酸的跨膜轉(zhuǎn)運，影響NO 的生成。SDMA大多以原形經(jīng)腎排泄，可作為影響

3、腎功能的一個指標。ADMA 作為一種內(nèi)源性的NOS 抑制劑而備受關(guān)注。在體內(nèi)它可以抑制內(nèi)皮細胞NO 的生成，增加氧自由基形成，誘導氧化應(yīng)激，增加單核細胞對內(nèi)皮細胞的粘附，誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙，并與脂代謝異常、高血壓、糖尿病、慢性腎功能衰竭、動脈粥樣硬化等諸多疾病密切相關(guān)。流行病學和前瞻性的醫(yī)學研究也證實，ADMA是血管內(nèi)皮功能障礙等相關(guān)疾病或急危重疾病獨立的危險因子。鑒于ADMA/SDMA 在心血管疾病機制研究中的重要作用，建立一個快捷

4、、準確和靈敏的分析方法顯得十分必要。目前國內(nèi)的文獻多數(shù)仍選擇HPLC 法作為檢測手段，只能檢測ADMA 一個化合物，生物樣品處理過程中需要加入衍生化試劑，操作繁瑣，檢測時間也過長。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：建立一個快捷、準確、靈敏的LC-MS/MS方法同時測定人血漿中ADMA/SDMA的濃度。以右美沙芬為內(nèi)標，血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，以乙腈：甲酸銨-甲酸緩沖溶液（含5 mmol·L-1 甲酸銨，0.1％甲酸）（5﹕

5、95，v/v）為流動相，采用Hypercarb柱分離，通過電噴霧三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，以選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）和正離子方式進行檢測。用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 203.1→46（ADMA），m/z203.1→172.1（SDMA），m/z 272.2→171（內(nèi)標）。ADMA 和SDMA 的線性范圍為0.12~2.48 μM，最低定量濃度為0.12 μM。日內(nèi)、日間精密度RSD<17.08％，準確度（RE）在97.70％~107.2

6、7％范圍內(nèi)。對130 例臨床病例的檢測結(jié)果證實，正常對照組測得的ADMA 濃度在0.4~0.6 μM，與多數(shù)文獻測得的正常值范圍相符，而患有高血壓、糖尿病的人群血漿ADMA 值高于正常對照組，檢測方法可靠易行。
　　 第二部分：對130例臨床病例進行了回顧性地分析，研究ADMA 濃度與臨床各個指標之間的相關(guān)性。⑴首先對炎癥因子C 反應(yīng)蛋白與ADMA 的相關(guān)性作了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADMA 與C 反應(yīng)蛋白的相關(guān)性不顯著（P= 0.9

7、08），反而與SDMA 的濃度呈正相關(guān)（r = 0.196，P=0.042）；⑵其次按照疾病因素的不同對130 例臨床病例進行統(tǒng)計分析，分為正常對照組、高血壓組、糖尿病組、高血壓合并糖尿病組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓組較正常組（0.63±0.13 vs.0.55±0.09, P=0.002），糖尿病組較正常組（0.62±0.11 vs. 0.55±0.09, P=0.038）高血壓合并糖尿病組較正常組（0.66±0.08 vs. 0.55±0.0

8、9, P=0.000），三個疾病組患者的ADMA 濃度都有顯著性的提升。而高血壓合并糖尿病組的血漿ADMA 濃度較單純高血壓組（0.66±0.08 vs. 0.63±0.13, P=0.208）或糖尿病的患者（0.66±0.08vs. 0.62±0.11, P=0.116）并沒有統(tǒng)計學的差異；⑶進一步加入腦血管病史、吸煙兩個心血管風險因素，再次進行分組。風險因子個數(shù)0 為正常對照，1~2 為低風險組，大于2 為高風險組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組之間