非對(duì)稱性二甲基精氨酸與糖尿病大鼠肝臟線粒體功能障礙.pdf

1、研究背景和目的：胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙是糖尿病的兩大重要病理基礎(chǔ)；這兩者的發(fā)生發(fā)展與線粒體功能障礙密切相關(guān)。大量研究表明，胰島素抵抗的小鼠、1型及2型糖尿病動(dòng)物和患者均伴有骨骼肌、肝臟和脂肪組織中線粒體氧化磷酸化活性下降，ATP生成減少，線粒體功能障礙。線粒體最主要的功能是合成ATP，線粒體ATP的生成不僅由線粒體呼吸酶如琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶活性以及線粒體膜電位決定，還與線粒體生物合成密切相關(guān)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ

2、輔激活因子1α(PGC-1α)是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵基因；此外，線粒體基因如細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1(COXI)與核基因如β-actin的比值亦可用來表示線粒體DNA的相對(duì)含量，間接反映線粒體生物合成。近年來發(fā)現(xiàn)，解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)在線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)中起重要作用，是線粒體ATP生成減少的另一重要原因。UCP2通過介導(dǎo)質(zhì)子跨膜內(nèi)流，驅(qū)散線粒體內(nèi)膜的H+梯度，降低線粒體膜電位，使ADP磷酸化為ATP所需的跨膜電位勢(shì)能減

3、少，進(jìn)而使ATP生成減少，線粒體功能受損。此外，氧化應(yīng)激也與線粒體功能障礙密切相關(guān)，因?yàn)榫€粒體不僅是活性氧簇產(chǎn)生的主要部位，而且是活性氧簇攻擊的首要靶點(diǎn)。超氧化物也可通過刺激UCP2的表達(dá)，使質(zhì)子滲漏作用增強(qiáng)，加劇線粒體功能障礙。 我室和國內(nèi)外研究表明，內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物——非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)升高在胰島素抵抗、糖尿病以及糖尿病血管并發(fā)癥中起重要作用。內(nèi)源性ADMA不僅可抑制NOS活性，減少一氧化氮(

4、NO)生成：還可使NOS解偶聯(lián)，促進(jìn)超氧化物生成。最近有研究報(bào)道，外源性NOS抑制劑L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)可進(jìn)一步增加花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位下降，而用一氧化氮(NO)供體S-亞硝基乙酰青霉胺(SNAP)孵育則相反：神經(jīng)型NOS(nNOS)缺失的小鼠腦、骨骼肌和心肌組織中細(xì)胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶的活性均明顯降低。由此提示NO在線粒體功能調(diào)節(jié)中的重要作用?；贏DMA是體內(nèi)NO合成的主要抑制物、NO與線

5、粒體功能障礙有關(guān)以及線粒體功能障礙和ADMA在糖尿病中的重要作用，我們推測(cè)ADMA很可能通過抑制NOS活性，降低NO生成或增加氧自由基生成，干擾線粒體功能，促進(jìn)糖尿病及其血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。因此，本課題以糖尿病大鼠肝臟和培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞系(H4IIE)作為研究對(duì)象，探討ADMA在糖尿病大鼠肝臟線粒體功能障礙中的作用；為闡明糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為糖尿病臨床防治開拓新思路。 方法： ①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：采用一次性腹

6、腔注射大劑量鏈脲佐菌素(60mg/kg)誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型；采用高脂飼養(yǎng)4周加小劑量鏈脲佐菌素(35 mg/kg)腹腔注射的方法制備2型糖尿病大鼠模型，繼續(xù)喂養(yǎng)8周后，檢測(cè)兩型糖尿病大鼠的血糖以及2型糖尿病大鼠血中胰島素水平和胰島素敏感性指數(shù)等來評(píng)價(jià)糖尿病模型；用高效液相法檢測(cè)血清ADMA濃度；用比色法測(cè)定糖尿病大鼠肝臟中線粒體琥珀酸脫氫酶及細(xì)胞色素C氧化酶活性，熒光分光光度法檢測(cè)線粒體膜電位，生物發(fā)光法測(cè)定ATP含量等指標(biāo)來評(píng)價(jià)線

7、粒體功能；并對(duì)血清ADMA水平與反映線粒體功能的四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定肝臟PGC-1α基因的mRNA水平及用PCR方法檢測(cè)線粒體基因COX I與核基因β-actin的拷貝數(shù)比值來反映線粒體的生物合成；用硫代巴比妥酸法測(cè)定大鼠肝臟丙二醛(MDA)含量及用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化及抗氧化水平；用硝酸還原酶法檢測(cè)大鼠肝臟NO含量；用比色法測(cè)定肝臟NOS活

8、性； ②細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用外源性ADMA(30 μmol/L)孵育大鼠肝細(xì)胞系H4IIE細(xì)胞48小時(shí)后，觀察ADMA對(duì)細(xì)胞線粒體功能和線粒體生物合成的影響；此外，還用RT-PCR測(cè)定解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并檢測(cè)細(xì)胞NO含量、NOS活性，MDA水平以及SOD活性；以探討ADMA引起線粒體功能障礙的可能機(jī)制。 結(jié)果： ①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，鏈脲佐菌素(60 mg/kg)誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠血糖水平明顯升高；高

9、脂飼養(yǎng)加鏈脲佐菌素(35 mg/kg)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠血糖、胰島素水平顯著升高，胰島素敏感性指數(shù)明顯降低，表明1型及2型糖尿病大鼠模型建立成功。飼養(yǎng)8周后，1型及2型糖尿病大鼠血清內(nèi)源性ADMA濃度顯著升高(P<0.01)，并伴有肝臟線粒體琥珀酸脫氫酶(P<0.01)及細(xì)胞色素C氧化酶活性(P<0.05)明顯下降，線粒體膜電位降低(P<0.05)，ATP生成減少(P<0.01)；經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清ADMA濃度與反映線粒體功能的四

10、個(gè)指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。此外，肝中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加，SOD活性顯著下降(P<0.01)；肝臟NO含量及NOS活性明顯降低(P<0.01)。 ②細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用1～30 μmol/L ADMA孵育大鼠肝細(xì)胞H4IIE 12～48h，呈劑量和時(shí)間依賴性降低細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性，尤其以30μmol/L ADMA孵育細(xì)胞48h時(shí)酶活性降低最明顯。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們采用30μmol/L ADMA孵

11、育H4IIE細(xì)胞48h，結(jié)果顯示ADMA顯著抑制細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶活性、降低線粒體膜電位、減少ATP生成，并上調(diào)UCP2的mRNA表達(dá)；另外，ADMA也下調(diào)PGC-1α的mRNA水平，減少線粒體DNA含量，抑制線粒體生物合成。此外，ADMA還抑制細(xì)胞NOS活性，減少NO生成，并升高細(xì)胞培養(yǎng)液中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量、降低SOD活性。30μmol/L的L-NAME具有與ADMA類似的作用；而用NO供體硝普鈉或抗氧