牛ISG15基因、IL8基因遺傳多態(tài)性及其與乳質(zhì)性狀和體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、不同泌乳時(shí)期水（奶）牛外周血白細(xì)胞牛全基因組表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)分析表明，牛泌乳前期到中期、中期到后期有多個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)2倍的上調(diào)或下調(diào)，其中ISG15和IL8均呈現(xiàn)泌乳前期到中期的表達(dá)下降，然后中期到后期的表達(dá)上升這樣一種趨勢。鑒于ISG15和IL8在先天性免疫和獲得性免疫中的重要作用，我們將ISG15和IL8基因作為牛疾病抗性的重要候選基因，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplification of cDNA ends，R

2、ACE)技術(shù)克隆溫州水牛ISG15和IL8基因全長序列，分別設(shè)計(jì)覆蓋牛ISG15和IL8基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase ChainReaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)引物，對(duì)比了中國荷斯坦牛、溫嶺高峰牛、天臺(tái)黃牛、魯西黃牛和溫州水牛IL8基因的單核苷酸多態(tài)性，中國荷斯坦牛、魯西黃牛和溫州水牛ISG15基因的單核苷酸多態(tài)性，并進(jìn)行了這

3、些單核苷酸多態(tài)性與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分析，為提高牛抗病性能和改善泌乳性能提供理論基礎(chǔ)。
　　1溫州水牛ISG15基因克隆及其生物信息學(xué)分析
　　利用RACE技術(shù)獲得了溫州水牛ISG15基因的全長序列。該基因mRNA全長629bp，其中5'UTR長度為72 bp(1～72 bp);開放閱讀框465 bp(73～535bp)，編碼154個(gè)氨基酸;3' UTR92 bp(536～629 bp)。ISG15基因的DNA全長包括兩個(gè)外顯子

4、(1458～1460bp和1897～2424bp)和一個(gè)內(nèi)含子(1461-1896bp)，基因結(jié)構(gòu)與其它哺乳動(dòng)物ISG15基因結(jié)構(gòu)一致。推定的溫州水牛ISG15蛋白分子量為17333.1Da。溫州水牛ISG15蛋白與水牛(AAZ38149.1)同源性最高，為99％。ISG15蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，溫州水牛ISG15蛋白具有信號(hào)肽的幾率為13.8％。
　　2溫州水牛IL8基因克隆及其生物信息學(xué)分析
　　利用RACE技術(shù)獲

5、得了溫州水牛IL8基因的全長序列1522 bp。該基因mRNA5'UTR長度為82 bp(1～82 bp);開放閱讀框306 bp(83～388 bp)，編碼101個(gè)氨基酸;3'UTR1134 bp(389～1522 bp)。ISG15基因的DNA全長序列包括4個(gè)外顯子（74～137bp、1690～1839bp、2113～2196bp和2639～2660bp）和3個(gè)內(nèi)含子(138～1689bp、1840～2112bp和2197～2638

6、bp)，基因結(jié)構(gòu)與其它哺乳動(dòng)物IL8基因結(jié)構(gòu)一致。推定的溫州水牛IL8蛋白分子量為11305.4Da。溫州水牛IL8蛋白與水牛(AAW67481.1)和牛(ACI23534.1)同源性最高，為100％。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，溫州水牛IL8蛋白的第31至92位氨基酸殘基處存在SCY功能域(Intercrine alpha family，chemokineCXC)。
　　3牛ISG15基因PCR-SSCP檢測及其多態(tài)性分析
　

7、　182頭中國荷斯坦奶牛尾靜脈血采自于浙江省金華市伊康乳業(yè)奶牛場。溫州水牛尾靜脈血采自浙江省溫州市平陽縣挺志溫州水牛乳業(yè)有限公司(32頭)和湖北省荊門市沙洋縣五里鎮(zhèn)奶水牛養(yǎng)殖示范基地（102頭）。19頭溫嶺高峰牛靜脈血采自溫嶺畜牧獸醫(yī)站。22頭天臺(tái)黃牛靜脈血采自天臺(tái)畜牧獸醫(yī)站。血液均經(jīng)過EDTA Na2抗凝，以進(jìn)行后續(xù)的外周血白細(xì)胞總RNA和DNA的提取。魯西黃?；蚪MDNA樣品(55個(gè)個(gè)體)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所李俊雅研究

8、員提供。
　　使用了15對(duì)引物對(duì)中國荷斯坦牛、魯西黃牛和溫州水牛ISG15基因進(jìn)行了PCR-SSCP檢測。中國荷斯坦牛群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了g.2241G→A的突變，并且該突變屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。溫州水牛群體內(nèi)則存在g.374G→A、g.433C→T、g.1806G→C和g.2104G→A這4個(gè)突變，其中g(shù).374G→A和g.2104G→A屬于低度多態(tài)性(PIC＜0.25)，g.433C→T和g.1806G→C屬于中

9、度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。x2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，溫州水牛群體中g(shù).433C→T和g.1806G→C偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)。魯西黃牛群體內(nèi)未篩選到突變。
　　中國荷斯坦牛和溫州水牛篩選到的突變位點(diǎn)與乳質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，g.2241G→A可顯著影響中國荷斯坦牛的乳蛋白率(P＜0.05)，極其顯著影響中國荷斯坦牛的體細(xì)胞評(píng)分。溫州水牛群體內(nèi)的突變位點(diǎn)與其乳質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果沒有發(fā)

10、現(xiàn)有顯著影響的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。
　　4牛IL8基因PCR-SSCP檢測及其多態(tài)性分析
　　使用了17對(duì)引物對(duì)中國荷斯坦牛、溫嶺高峰牛、天臺(tái)黃牛、魯西黃牛和溫州水牛IL8基因進(jìn)行了PCR-SSCP檢測。中國荷斯坦牛、溫嶺高峰牛、天臺(tái)黃牛、魯西黃牛群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了g.-63G→A、g.249 C→T、g.311 C→T、g.349 A→G、g.1247C→T、g.1501G→T、g.1939A→C、g.1986 G→A、g.2256 T→

11、G、g.2269 G→A、g.2420G→A、g.2831 A→G、g.2904 T→C和g.3030 G→A突變。均屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。貯適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，g.1247C→T和g.1501G→T偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)。溫州水牛群體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。
　　中國荷斯坦牛IL8基因的連鎖不平衡分析顯示，該基因內(nèi)存在4個(gè)單倍域（Haplotype block），g.249 C→

12、T、g.1939 A→C、g.2256 T→G和g.2831 A→G為選擇的htSNP。 g.249 C→T與g.311 C→T、g.349 A→G, g.1939 A→C與g.1986 G→A, g.2256T→G與g.2269 G→A，g.2831 A→G與g.2904 T→C、g.3030 G→A之間的r2值為1，g.249 C→T可代替g.311 C→T和g.349 A→G效應(yīng)，g.1939A→C可代替g.1986 G→A效應(yīng)，

13、 g.2256 T→G可代替g.2269 G→A效應(yīng)，g.2831A→G可代替g.2904 T→C和g.3030G→A效應(yīng)。由g.249 C→T、g.1939A→C、g.2256 T→G和g.2831 A→G這四個(gè)htSNPs構(gòu)建的單倍型即可反映整個(gè)基因的單倍型信息。
　　中國荷斯坦牛SNPs與乳質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，g.-63G→A對(duì)305天產(chǎn)奶量有顯著影響(P＜0.05)，各基因型乳蛋白率呈現(xiàn)出GG＞GA＞AA的趨勢。g.

14、249C→T對(duì)305天產(chǎn)奶量和乳脂率有顯著影響(P＜0.05)。g.1247C→T對(duì)體細(xì)胞評(píng)分有顯著影響(P＜0.05)，各基因型乳脂率和體細(xì)胞評(píng)分呈現(xiàn)出CC＜CT＜TT的趨勢。g.1501G→T對(duì)305天產(chǎn)奶量有顯著影響(P＜0.05)，各基因型305天產(chǎn)奶量呈現(xiàn)出GG＜GT＜TT的趨勢。g.1939A→C對(duì)泌乳性狀沒有顯著影響，但發(fā)現(xiàn)各基因型乳脂率和體細(xì)胞評(píng)分呈現(xiàn)出AA＜AB＜BB的趨勢。g.2256T→G對(duì)乳脂率有顯著影響(P＜0