小檗堿對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響及其衍生物抗糖尿病活性的研究.pdf

1、糖尿病是以血糖增高為主要表現(xiàn)的累及全身的代謝性疾病，但血糖的增高僅發(fā)生在胰島β細(xì)胞功能受損、衰竭時(shí)。近年來(lái)，β細(xì)胞功能的研究已成為糖尿病研究的重點(diǎn)方向，而其內(nèi)容主要包括胰島素分泌及胰島素合成兩方面。隨著糖尿病研究理論的更新以及新的作用機(jī)制的不斷發(fā)現(xiàn)，抗糖尿病藥物也從最早的以“竭澤而漁”式的刺激胰島素分泌降低血糖為目的，發(fā)展為以通過(guò)降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、緩解并發(fā)癥并抑制β細(xì)胞凋亡達(dá)到多方位綜合治療糖尿病為目標(biāo)。而保護(hù)β細(xì)胞功

2、能則成為抗糖尿病藥物研究的熱點(diǎn)。小檗堿是中藥黃連中的主要生物堿，其抗糖尿病作用多年前已被報(bào)道。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)其具有降低血甘油三酯及膽固醇的作用，并可能促進(jìn)GLP-1的分泌，提示其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的價(jià)值很大。關(guān)于小檗堿對(duì)外周胰島素敏感組織的作用機(jī)制研究較多，但其對(duì)胰島β細(xì)胞功能的研究鮮見(jiàn)，本論文以考察小檗堿對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響為目的，重點(diǎn)研究其對(duì)胰島素基因表達(dá)的影響，并研究小檗堿結(jié)構(gòu)修飾的化合物的抗糖尿病活性。
　　 論文第一部分考

3、察了鹽酸小檗堿(50 mg/kg)對(duì)代謝綜合征動(dòng)物模型MSG小鼠及2型糖尿病動(dòng)物模型C57/BL小鼠的抗糖尿病活性并初步評(píng)價(jià)了其在整體水平對(duì)胰島β細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩種小鼠模型，鹽酸小檗堿能夠顯著改善動(dòng)物的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)及葡萄糖耐量異常狀態(tài);降低空腹血清胰島素水平;有降低小鼠胰腺脂質(zhì)積聚的趨勢(shì)。這些結(jié)果提示小檗堿通過(guò)改善糖脂代謝，減輕了糖脂對(duì)β細(xì)胞的毒性作用，對(duì)β細(xì)胞發(fā)揮有益作用。胰島病理切片結(jié)果顯示鹽酸小檗堿能夠延緩C57/

4、BL小鼠胰腺組織病變進(jìn)展，維持β細(xì)胞形態(tài);兩種動(dòng)物模型的胰島素免疫組織化學(xué)染色均顯示動(dòng)物胰島內(nèi)胰島素含量降低，提示小檗堿對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素表達(dá)可能存在直接的調(diào)控作用。
　　 在第一部分研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，論文第二部分進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，主要目的是考察鹽酸小檗堿對(duì)胰島β細(xì)胞的胰島素水平是否具有直接調(diào)節(jié)作用并探討其機(jī)制及意義。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Real time PCR的方法證明了鹽酸小檗堿對(duì)胰島β細(xì)胞系NIT-1細(xì)胞及正常ICR小鼠原代胰島內(nèi)胰島

5、素基因Ins-1及Ins-2表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，并且這種表達(dá)抑制作用在蛋白水平亦能夠體現(xiàn)。為了進(jìn)一步研究鹽酸小檗堿對(duì)胰島素基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本部分論文中建立了考察胰島素基因啟動(dòng)子活性的研究方法。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)應(yīng)用不同濃度的葡萄糖、軟脂酸及陽(yáng)性參照藥物exendin-4，證明所構(gòu)建的兩種報(bào)告基因質(zhì)粒對(duì)于調(diào)節(jié)胰島素基因表達(dá)的生理性物質(zhì)及外源性藥物反應(yīng)敏感準(zhǔn)確，證明該方法可用于進(jìn)一步考察藥物對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控。隨后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用所構(gòu)建的質(zhì)?？疾禧}酸小檗

6、堿的作用，結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿對(duì)胰島素基因啟動(dòng)子活性具有抑制作用，這種抑制作用存在明顯量效及時(shí)程關(guān)系，并與文獻(xiàn)中與其作用機(jī)制相似的藥物鹽酸二甲雙胍存在較明顯的差別。本部分最后進(jìn)行了信號(hào)通路的研究及功能意義的初步探討，結(jié)果顯示AMPK抑制劑Compound C能夠阻斷小檗堿對(duì)胰島素基因表達(dá)的下調(diào)作用，提示小檗堿對(duì)胰島素基因表達(dá)的調(diào)控依賴于此通路。Real time PCR還顯示小檗堿能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路關(guān)鍵蛋白CHOP的mRNA表達(dá)，提

7、示其可能通過(guò)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力改善β細(xì)胞功能。轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平測(cè)定表明，Pdx-1可能參與小檗堿對(duì)胰島素基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 國(guó)內(nèi)已有報(bào)道以小檗堿化學(xué)結(jié)構(gòu)為先導(dǎo)化合物，通過(guò)研究其衍生物發(fā)現(xiàn)調(diào)脂作用更好的化合物，從而提示此方面研究的重要意義。論文第三部分首先應(yīng)用葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)，測(cè)定系列小檗堿衍生化合物對(duì)肝細(xì)胞系及前脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響并與小檗堿作對(duì)比，從48個(gè)化合物中篩選出6個(gè)進(jìn)行整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)化合物WS0704002