視黃酸對鞏膜重塑及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Fibulin-1表達(dá)的影響.pdf

1、在環(huán)境因素(如長時間的近距離用眼)及遺傳因素等眾多因素的共同作用下，近視眼(Myopia)的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國南方地區(qū)15歲青少年近視患病率已達(dá)到78.4％。近視眼患病影響視覺質(zhì)量的同時，也會造成視網(wǎng)膜的病理性損害，如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性，視網(wǎng)膜脫離等，從而導(dǎo)致不可逆性視力損害甚至致盲。近視眼作為全球性的醫(yī)學(xué)及社會問題，一直是眼科研究的熱點(diǎn)。然而由于近視眼的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，對近視眼的預(yù)防和治療仍無較大突破。<

2、br>　　 研究資料表明，早期發(fā)育時，視覺刺激誘導(dǎo)眼內(nèi)局部生物化學(xué)信號通路，調(diào)控眼球生長及眼鞏膜重塑，從而影響正視化過程，最終影響眼球的屈光狀態(tài)。最新研究表明視黃酸與視覺控制眼球生長有關(guān)，它作為一種信號因子通過在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的合成和分泌，對眼球生長過程中鞏膜的重塑起重要的作用。
　　 鞏膜重塑是近視眼發(fā)生和發(fā)展中的重要生物學(xué)改變，它與鞏膜細(xì)胞的分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)的動態(tài)平

3、衡密切相關(guān)。Fibulin-1是重要的ECM支架蛋白，它參與形成ECM的超分子結(jié)構(gòu)，影響組織重塑過程，參與神經(jīng)嵴來源組織(包括鞏膜)的形態(tài)發(fā)育過程。Fibulin-1在鞏膜中的作用尚不清楚，在鞏膜重塑中，它與視黃酸信號因子是否存在關(guān)系?因此，從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探討視黃酸對鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)的影響及對fibulin-1的影響，為近視眼發(fā)病機(jī)制的研究提供新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，將對近視眼的防治具有重要意義。
　　 第一部分、外源性視黃酸

4、對豚鼠鞏膜重塑的研究
　　 目的：觀察外源性視黃酸對三色豚鼠眼軸生長和屈光變化的影響；觀察視黃酸對豚鼠鞏膜膠原，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白aggrecan及fibulin-1的影響，明確外源性視黃酸在實(shí)驗(yàn)性眼軸增長中對鞏膜的作用。
　　 方法：選用100克左右3-4天三色豚鼠20只，隨機(jī)分為正常對照組(P.O.)和實(shí)驗(yàn)組(R.A.)。實(shí)驗(yàn)組予24 mg/kg連續(xù)五天每天喂飼花生油配制的視黃酸0.5ml，正常對照組喂飼0.5ml花生油

5、，兩組豚鼠實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食、飲水，第5天分別測量其眼軸長度、屈光度，觀察其變化。用HE染色測量實(shí)驗(yàn)組鞏膜和正常組鞏膜的厚度變化并通過透射電鏡觀察鞏膜成纖維細(xì)胞的變化及膠原纖維的改變，通過免疫熒光法檢測aggrecan及fibulin-1在豚鼠實(shí)驗(yàn)組和正常對照組鞏膜中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前豚鼠的屈光狀態(tài)和眼軸長度，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)第5天，對照組豚鼠的眼軸長度為7.628±0.009 mm，實(shí)驗(yàn)組豚鼠

6、眼軸長度為7.743±0.005 mm，兩組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。對照組的豚鼠眼的屈光度數(shù)為+6.50±1.60D，實(shí)驗(yàn)組的豚鼠眼的屈光度數(shù)+1.73±0.80D。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的豚鼠眼分別增加了-4.80D的相對近視，屈光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。分別將對照組和實(shí)驗(yàn)組后極部鞏膜HE染色，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組鞏膜比對照組鞏膜變薄。透射電鏡結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組鞏膜膠原數(shù)量減少，直徑變小。免疫組化的結(jié)果顯示，和對照組相比

7、，實(shí)驗(yàn)組鞏膜中aggrecan的表達(dá)明顯降低，而fibulin-1表達(dá)增高。
　　 結(jié)論：視黃酸在豚鼠眼球發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，外源性視黃酸的給予能穩(wěn)定有效的誘導(dǎo)眼軸增長，形成相對性的近視漂移并直接引起鞏膜重塑。其中鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白aggrecan和fibulin-1的改變可能參與了RA誘導(dǎo)的鞏膜重塑并進(jìn)一步導(dǎo)致鞏膜變薄。
　　 第二部分、視黃酸對人鞏膜成纖維細(xì)胞Fibulin-1表達(dá)的影響
　　 目的：

8、本研究旨在觀察全反式視黃酸(all-trans retinoic acid，RA)對培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細(xì)胞(humans fibroblasts，HSFs)的形態(tài)、增殖影響以及檢測RA對HSFs中fibulin-1表達(dá)的影響，明確RA與fibulin-1的關(guān)系并進(jìn)一步探討fibulin-1在鞏膜重塑中的作用。
　　 方法：體外分離并培養(yǎng)HSFs，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HSFs中fibulin-1的表達(dá)情況。HSF傳代至第三

9、代，以1×105/孔的密度接種于96孔板，通過CCK-8(Cell Counting Kit-8)法分析不同濃度RA(10-9M～10-4M)作用24小時及48小時對細(xì)胞增殖的影響。用Real-time PCR和Western Blot的方法測定RA作用下24、48小時后fibulin-1的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果證實(shí)fibulin-1在HSFs中弱表達(dá)。高濃度的RA(大于或等于10-5M)對細(xì)胞有明顯的

10、抑制作用，該效應(yīng)呈劑量依賴性反應(yīng)，其半數(shù)抑制率IC50=5×10-5M。進(jìn)一步選取RA濃度(10-8M～10-5M)刺激HSFs24h，HSFs中fibulin-1mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，有濃度和時間依從性，其最大效應(yīng)濃度為10-7M。Western Blot結(jié)果也證實(shí)，用10-7MRA干預(yù)細(xì)胞24及48小時，HSFs中fibulin-1蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)fibulin-