轉(zhuǎn)錄輔活化因子hADA3與人乳頭瘤病毒癌蛋白E6的相關(guān)性研究.pdf

1、宮頸癌是女性第二大常見的惡性腫瘤，是嚴(yán)重威脅全球婦女健康的重大疾病。高危人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)作為官頸癌的關(guān)鍵致病因子已得到公認(rèn)，其中早期蛋白E6是最主要的癌蛋白。對E6功能的首次認(rèn)識是通過對E6和P53相互作用的研究開始的，研究發(fā)現(xiàn)：E6蛋白的表達(dá)使E6結(jié)合P53和泛素蛋白連接酶E6-AP一起形成三聚體復(fù)合物，導(dǎo)致P53泛素化隨后被26S蛋白酶降解，最終導(dǎo)致P53介導(dǎo)的正常細(xì)胞周期停頓功能喪失，

2、官頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。官頸癌細(xì)胞中P53的泛素化降解必須有E6AP的參與，E6AP屬于泛素連接酶(ubiquitinligase)家族，正常體內(nèi)E6AP不與p53結(jié)合，而僅在表達(dá)HPVE6的情況下促成p53和E6AP結(jié)合，導(dǎo)致p53泛素化而降解。 然而隨著對E6功能的研究深入，發(fā)現(xiàn)E6降解P53并不能完全解釋E6的致癌機(jī)制：有研究發(fā)現(xiàn)喪失p53結(jié)合區(qū)的E6蛋白突變體，雖然無法降解P53，但仍具有細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化功能；在HPV陽性

3、的細(xì)胞中，也并不是總有p53降解的現(xiàn)象。隨后有學(xué)者提出HPVE6癌蛋白也通過其他途徑使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，又不斷發(fā)現(xiàn)新的E6相關(guān)蛋白，比如E6BP,hD1g，Bak等，但很多機(jī)制尚不清楚。因此，從E6表達(dá)到官頸癌發(fā)生其實(shí)是個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中所涉及的基因表達(dá)調(diào)控和詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步闡明。而目前對轉(zhuǎn)錄輔活化因子領(lǐng)域的研究使HPV16E6致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的具體機(jī)理在基因調(diào)控層面有了更深入的研究。 yADA3

4、是酵母內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄輔活化因子，人類的同源基因?yàn)閔ADA3。以往對酵母的研究發(fā)現(xiàn)yADA3作為核受體轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵輔活化因子，從而啟動(dòng)許多重要靶基因的轉(zhuǎn)錄激活途徑。盡管目前對人類同源體hADA3蛋白的功能還不是很了解，但由于其氨基酸序列的高度保守，我們推測hADA3與yADA3類似，也可能作為一種輔活化因子參與許多重要分子的轉(zhuǎn)錄激活途徑。有研究表明hADA3參與P53下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活及細(xì)胞周期停頓功能；也有研究發(fā)現(xiàn)hADA3參與雌激素

5、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活途徑。P53和雌激素受體都是轉(zhuǎn)錄因子的重要成員，因此，hADA3蛋白是否極有可能也參與E6的致癌途徑？而E6AP是否也參與宮頸癌細(xì)胞中hADA3蛋白的調(diào)節(jié)過程？ 本研究擬通過RNA干擾技術(shù)，分別干擾SiHa細(xì)胞中E6和E6AP表達(dá)，觀察hADA3蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況，研究E6與hADA3蛋白，以及E6AP與hADA3蛋白的相互關(guān)系，以闡明hADA3作為E6新的靶蛋白在E6致癌過程中所起的作用。

6、 第一部分 siRNA靶向HPV16E6和E6AP的基因沉默 目的： 利用RNA干擾技術(shù)分別靶向HPV16E6和E6AP基因沉默方法： 設(shè)計(jì)若干對靶向HPV16E6和E6AP的siRNA，體外轉(zhuǎn)錄合成，并將siRNA轉(zhuǎn)染入官頸癌細(xì)胞株SiHa中，分別觀察E6和E6AP的mRNA表達(dá)情況，以篩選出干擾效果最佳的一對siRNA、濃度和時(shí)間。 結(jié)果： E6-CsiRNA使E6mRNA表達(dá)下降，干擾濃度

7、和時(shí)間分別為30uM和48小時(shí)，E6AP-BsiRNA使E6APmRNA表達(dá)下降，干擾濃度和時(shí)間分別為40uM和48小時(shí)。 結(jié)論： 1、體外轉(zhuǎn)錄合成的靶向HPV16E6的siRNA可有效沉默病毒基因E6。 2、體外轉(zhuǎn)錄合成的靶向E6AP的siRNA可有效沉默E6AP基因。 第二部分 HPVE6誘導(dǎo)E6AP參與的轉(zhuǎn)錄輔活化因子hADA3表達(dá)抑制 目的： 明確轉(zhuǎn)錄輔活化因子hADA3蛋白在HP

8、VE6致癌途徑中的作用；證實(shí)E6AP參與官頸癌細(xì)胞中hADA3蛋白表達(dá)抑制的過程。 方法： 1、將篩選得到的E6-CsiRNA轉(zhuǎn)染入官頸癌細(xì)胞株SiHa中，觀察E6和hADA3的表達(dá)情況，以及細(xì)胞的生長、增殖和凋亡情況。 2、將篩選得到的E6AP-BsiRNA轉(zhuǎn)染入官頸癌細(xì)胞株SiHa中，觀察E6AP和hADA3的表達(dá)情況，以及細(xì)胞的生長、增殖和凋亡情況。 結(jié)果： 1、E6-CsiRNA干擾后，E