髓源及非髓源Toll樣受體4在肝臟缺血再灌注Ⅱ期損傷中的作用.pdf

1、肝臟缺血再灌注 損傷的核心是過度的炎癥反應(yīng)。該損傷分為兩個(gè)時(shí)相：I 相主要為激活的枯否細(xì)胞連同其分泌的細(xì)胞因子引起的損傷；II 相則是在KC，趨化性細(xì)胞因子、粘附分子等共同作用下，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞趨化、黏附、聚集、活化所介導(dǎo)的損傷。后者是肝臟I/R 損傷的關(guān)鍵，其結(jié)果是肝細(xì)胞的壞死和凋亡，最終引起肝功能衰竭、甚至全身多臟器功能障礙綜合征。
　　 Toll樣受體4是新近發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)機(jī)體急性炎癥反應(yīng)的受體，在天然免疫中起重要作用。通過該

2、受體可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，啟動(dòng)機(jī)體的炎癥防御機(jī)制。已證明TLR4 參與肝臟I/R 損傷。TLR4分布于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liver sinusoidal endothelia cells，LSEC)、KC 及PMN，雖然肝細(xì)胞也表達(dá)TLR4，但一般認(rèn)為該細(xì)胞的TLR4 不參與肝臟I/R 損傷。有人證實(shí)在同一臟器組織中，不同細(xì)胞表達(dá)的TLR4在急性炎癥過程中的作用不同。用氯化釓阻斷肝臟KC 細(xì)胞功能后，雖然可減輕肝I/R 損傷，但是與假手

3、術(shù)對照比較，仍有明顯損傷，提示除KC 外，其它細(xì)胞如PMN 及LSEC 表達(dá)的TLR4 也可能參與啟動(dòng)肝臟I/R的炎癥過程。因此，本研究目的在于觀察肝臟內(nèi)不同細(xì)胞表面TLR4在肝I/R 損傷中的作用，闡明其通過招募、活化PMN 而參與肝臟I/R II 期損傷的機(jī)制。
　　 一、骨髓移植小鼠模型的建立及鑒定
　　 將兩種純系雄鼠C3H/HeJ (TLR4Mut/Mut)及C3H/HeN (TLR4+/+)的骨髓分別移植于同

4、系雌鼠或交叉移植于相應(yīng)品系的雌鼠，骨髓移植10周后，通過比較接受及未接受骨髓移植小鼠的死亡率，用FISH和PCR檢測受者的Y染色體及SRY基因，證實(shí)骨髓移植成功。故本研究獲取了以下2種純合體小鼠和2種嵌合體小鼠，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究不同細(xì)胞表面TLR4在肝臟I/R損傷中的作用奠定基礎(chǔ)。小鼠名稱供體基因型受體基因型表型WT/WT TLR4+/+TLR4+/+源細(xì)胞TLR4+/+/非髓源細(xì)胞TLR4+/+Mut/Mut TLR4 Mut/Mut

5、TLR4 Mut/Mut 源細(xì)胞TLR4 Mut/Mut/非髓源細(xì)胞TLR4 Mut/MutWT/Mut TLR4+/+TLR4 Mut/Mut 源細(xì)胞TLR4+/+/非髓源細(xì)胞TLR4 Mut/MutMut/WT TLR4Mut/Mut TLR4+/+源細(xì)胞TLR4 Mut/Mut/非髓源細(xì)胞TLR4+/+.
　　 二、比較髓源及非髓源細(xì)胞TLR4在肝臟I/RⅡ期損傷中的作用
　　 用上述4種類型的小鼠建立肝臟部分缺血

6、再灌注損傷動(dòng)物模型。各組動(dòng)物模型中門靜脈血清無內(nèi)毒素污染，外周血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平明顯上升，HE及電鏡顯示肝細(xì)胞受損，炎性細(xì)胞浸潤，且均在肝臟恢復(fù)灌注6-12小時(shí)最為顯著。四組比較，在恢復(fù)灌注6小時(shí)及12小時(shí)，Mut/Mut小鼠肝損傷最輕，而髓源細(xì)胞TLR4突變者組(Mut/WT)小鼠肝組織損傷較髓源細(xì)胞TLR4野生型組(WT/Mut)輕 (P＜0.05)，提示髓源及非髓源細(xì)胞TL

7、R4均參與了肝臟I/RⅡ期損傷，但髓源細(xì)胞TLR4的作用更大。
　　 三、髓源及非髓源細(xì)胞TLR4參與肝臟I/R Ⅱ期損傷的機(jī)制研究
　　 為進(jìn)一步探討髓源及非髓源細(xì)胞TLR4 參與肝臟I/RⅡ期損傷的機(jī)制，我們主要觀察上述4種動(dòng)物肝臟缺血再灌注Ⅱ期損傷時(shí)中性粒細(xì)胞的變化，證實(shí)：
　　 1．髓源及非髓源細(xì)胞細(xì)胞TLR4在肝臟I/R 時(shí)對PMN 聚集的影響：用特異性酯酶D 對中性粒細(xì)胞進(jìn)行特異性染色和記數(shù)，并測定其

8、產(chǎn)生的髓過氧化物酶。
　　 結(jié)果證實(shí)在恢復(fù)灌注后3小時(shí)，各組肝組織間隙內(nèi)PMN 水平明顯上升，6 至12小時(shí)仍維持在較高水平。四組比較，恢復(fù)灌注6小時(shí)，WT/WT組PMN 水平最高，Mut/Mut 最低，髓源細(xì)胞TLR4 野生型組(WT/Mut)高于髓源細(xì)胞TLR4 突變型(Mut/WT)(p<0.05)；恢復(fù)灌注12小時(shí)，WT/WT組與髓源細(xì)胞TLR4 野生型組(WT/Mut)的PMN 聚集均高于髓源細(xì)胞TLR4 突變型(Mu

9、t/WT)組及Mut/Mut組(p<0.05)。提示在肝臟I/RⅡ期損傷中，PMN的聚集程度與TLR4 相關(guān)，且髓源細(xì)胞表面TLR4的作用較大。
　　 2．髓源及非髓源細(xì)胞TLR4在肝臟I/R 時(shí)對參與PMN 募集相關(guān)因素的影響：
　　 (1)促炎細(xì)胞因子：用ELISA檢測證實(shí)在恢復(fù)灌注后3小時(shí)各組小鼠產(chǎn)生TNF-α和IL-1β達(dá)高峰。四組組間比較，WT/WT組的TNF-α，IL-1β水平最高，其次為髓源細(xì)胞TLR4 野

10、生型組(WT/Mut)，均高于髓源細(xì)胞TLR4 突變型組(Mut/WT)，而Mut/Mut組水平最低，組間差異有顯著性。
　　 (2)趨化性細(xì)胞因子：用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)各組內(nèi)MIP-2 水平在再灌注3小時(shí)及6小時(shí)最高，四組組間差異與促炎細(xì)胞因子相似。
　　 (3)黏附分子：用用Western 證實(shí)Mac-1/CD11b在I/R 損傷晚期明顯升高，其組間差異與上相同。ICAM-1的表達(dá)亦在I/R 損傷晚期明顯升高，與Ma

11、c-1/CD11b不同的是，雖然WT/WT組ICAM-1 表達(dá)最強(qiáng)，Mut/Mut組最弱，但髓源細(xì)胞TLR4突變型(Mut/WT)組表達(dá)強(qiáng)于髓源細(xì)胞TLR4 野生型組(WT/Mut)。ICAM-1 免疫組化結(jié)果與Western 結(jié)果一致，且在再灌注12小時(shí)，WT/WT組及髓源細(xì)胞TLR4突變型組(Mut/WT)肝細(xì)胞ICAM-1 染色呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而髓源細(xì)胞TLR4 野生型組(WT/Mut)及Mut/Mut小鼠肝細(xì)胞ICAM-1 染色僅

12、呈弱陽性。
　　 上述結(jié)果提示TLR4 影響肝臟缺血再灌注損傷中促炎細(xì)胞因子、趨化性細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá)，進(jìn)而影響PMN在肝臟I/RⅡ期損傷中的效應(yīng)。髓源細(xì)胞TLR4 主要促進(jìn)促炎細(xì)胞因子、趨化性細(xì)胞因子及Mac-1的表達(dá)，而非髓源細(xì)胞TLR4 對ICAM-1 表達(dá)的影響則更大。
　　 四、PMN/TLR4體外對肝臟I/R 局部介質(zhì)的應(yīng)答
　　 (1)TLR4對肝臟I/R的肝勻漿液趨化PMN的影響：我們在體外

13、用Transwell觀察缺血1小時(shí)再灌注3小時(shí)肝組織勻漿液對TLR4+/+PMN及TLR4Mut/MutPMN遷移及穿越內(nèi)皮能力的影響，結(jié)果證實(shí)WT/WT勻漿液組趨化作用最強(qiáng)，髓源細(xì)胞TLR4野生型組(WT/Mut)強(qiáng)于髓源細(xì)胞TLR4突變型組(Mut/WT)，Mut/Mut組作用最弱；此外，每組勻漿液對TLR4+/+PMN的趨化作用均強(qiáng)于趨化TLR4Mut/Mut PMN。提示髓源細(xì)胞TLR4不僅可通過影響趨化物質(zhì)的表達(dá)量來影響PMN

14、的遷移及內(nèi)皮穿越功能，而且PMN表面功能性TLR4尚可增強(qiáng)PMN對趨化物質(zhì)的敏感性。
　　 (2)TLR4對MIP-2介導(dǎo)PMN穿越內(nèi)皮能力的影響：用MIP-2 中和抗體可顯著抑制肝臟I/R的肝勻漿液誘導(dǎo)TLR4+/+PMN的內(nèi)皮穿越能力，對TLR4Mut/Mut PMN的影響力較弱，提示PMN的TLR4能增強(qiáng)其對MIP-2趨化能力的敏感性。
　　 (3)TLR4對CD11b介導(dǎo)PMN粘附及內(nèi)皮穿越能力的影響：用黏附實(shí)驗(yàn)

15、及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD11b中和抗體可明顯抑制TLR4+/+PMN的粘附能力及肝臟I/R的肝勻漿液誘導(dǎo)TLR4+/+PMN的定向運(yùn)動(dòng)能力及，且此影響均強(qiáng)于TLR4Mut/MutPMN，提示PMN的TLR4能增強(qiáng)其對CD11b的反應(yīng)性。
　　 (4)TLR4對TNF-α介導(dǎo)PMN聚集的影響：用TNF-α抗體中和各組肝組織勻漿液的TNF，結(jié)果對 TLR4+/+PMN及TLR4Mut/Mut PMN的趨化能力無影響；但TNF

16、-α卻能激活PMN，增強(qiáng)TLR4+/+PMN及TLR4Mut/Mut PMN穿越內(nèi)皮的能力，但兩者無顯著性差異。提示TNF-α可促進(jìn)PMN內(nèi)皮穿越能力，但該作用與TLR4無關(guān)。用TNF-α激活假手術(shù)TLR4+/+及TLR4Mut/Mut 鼠的 PMN，RT-PCR檢測證實(shí)TNF-α可促進(jìn)PMN CD11bmRNA及MIP-2 Mrna轉(zhuǎn)錄，但該作用與PMN的TLR4無關(guān)。
　　 (5)用 RT-PCR證實(shí)缺血再灌注刺激可增強(qiáng)TL

17、R4+/+及TLR4Mut/Mut PMN轉(zhuǎn)錄CD11b 及MIP-2 Mrna，但TLR4+/+PMN轉(zhuǎn)錄這兩種因子Mrna水平均高于TLR4Mut/Mut PMN，提示TLR4可上調(diào)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)PMN對這兩因子的表達(dá)。
　　 本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TLR4，特別是髓源細(xì)胞TLR4在肝臟I/R 時(shí)，通過促進(jìn)促炎細(xì)胞因子、趨化性細(xì)胞因子及粘附分子的表達(dá)來導(dǎo)致PMN在肝臟的聚集和活化，進(jìn)而介導(dǎo)I/RⅡ期損傷；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證