山羊胎兒皮膚黑色素生成有關(guān)miRNA的篩選與鑒定.pdf

1、黑色素生成是復(fù)雜的生理過程，關(guān)于膚色形成的機理已經(jīng)在人類醫(yī)學(xué)和多數(shù)動物上取得了很大的進展，但烏羊的烏皮中烏質(zhì)性狀的形成機理研究相對匱乏。微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的、長度約為18-25nt的內(nèi)源性單鏈RNA，屬于非編碼小分子RNA。研究報道，miRNAs在皮膚細(xì)胞發(fā)育、被毛及皮膚顏色控制中起著重要的作用。本研究以皮膚miRNA調(diào)控膚色為核心，對烏皮羊及白皮羊胎兒（100日齡）皮膚組織進行小RNA

2、 cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測序，尋找差異表達的miRNAs。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過對山羊皮膚組織小RNA cDNA文庫的測序，得到317個符合miRNA二級典型結(jié)構(gòu)特點的序列，其中187個序列是在miRBase v20.0.中已報道的山羊（capra hircus）和綿羊（ovis aries）的miRNAs;60個序列是在miRBase v20.0.0中有高度同源的候選miRNAs;70個序列在m

3、iRBase v20.0中無任何同源序列，與上述60個miRNAs合并為本研究新發(fā)現(xiàn)的miRNAs。這些新的miRNAs中103個隸屬于49個miRNA家族，剩余的miRNA不屬于任何家族。對130個新miRNAs序列進行了系統(tǒng)的命名，明確了其在山羊基因組上的座位及正負(fù)鏈上的位置。
　　2.本研究采取三個生物學(xué)重復(fù)，通過三個比較組對比，最終在烏皮羊和白皮羊100日齡胎兒皮膚中找到了62個差異表達的miRNA，其中31個在烏皮羊胎兒

4、皮膚中表達上調(diào)，另外31個在白皮羊胎兒皮膚中高表達。此外，我們選取10個差異表達的miRNAs對其進行Q-PCR表達驗證，隨機檢測的3個上調(diào)miRNA(oar-miR-544， chi-miR-196a和chi-miR-129-5p)，7個下調(diào)miRNA(oar-miR-133,oar-miR-381,oar-miR-655,oar-miR-543,oar-miR-299,novel-114和chi-miR-184)的Q-PCR表達結(jié)果

5、與Illumina測序分析中得到的結(jié)果相符合。
　　3.對62個差異表達的miRNAs進行靶基因的預(yù)測及通路顯著性富集分析，結(jié)果篩選與黑色素生成有關(guān)的86個候選靶基因。在這些差異表達miRNAs中，miR-381，miR-543，miR-129在黑色素生成關(guān)鍵基因MITF3'UTR區(qū)域有靶向結(jié)合位點;miR-544，miR-129在黑色素生成關(guān)鍵酶TYR3'UTR區(qū)域有靶向結(jié)合位點。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示

6、，miR-381，miR-543，miR-129與MITF具有靶向作用關(guān)系;miR-544，miR-129與TYR有靶向作用關(guān)系。同時利用基因本體論GO(Gene Ontology)分類對靶基因功能進行了系統(tǒng)的分類，結(jié)果表明這些基因可能參與包括細(xì)胞膜成分、分子功能及生物學(xué)進程的多個環(huán)節(jié)。
　　本研究從不同膚色山羊胎兒皮膚中篩選得到了差異表達的miRNAs，并初步發(fā)現(xiàn)miR-381，miR-543，miR-129和miR-544可能